tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法

1、TUNELTUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50300kb的大片段。然后大約30﹪的染色體DNA在Ca和Mg依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（Td

2、T）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nicktranslation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。TU

3、NEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用。一、過氧化物酶標(biāo)記測(cè)定法原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）11d

4、UTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1

5、％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測(cè)定。檢測(cè)晚期凋亡?；驹恚簩?duì)不同組織切片先增加細(xì)胞膜通透性，然后讓rTDT和bio標(biāo)記的dTUTP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在rTDT的輔助下dTUTP與核斷裂的DNA3’OH結(jié)合，再用HRP標(biāo)記的鏈霉親和素與dTUTP上biotin結(jié)合（每個(gè)鏈霉親和素至少可以再結(jié)合

6、3個(gè)biotin分子），最后用DAB、過氧化氫與SP上的辣根過氧化物酶HRP發(fā)生氧化、環(huán)化反應(yīng)，形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐色，最終通過計(jì)數(shù)每張切片上不同視野中TUNEL陽性細(xì)胞的比例來判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。羅氏試劑盒一、試劑1、酶濃縮溶液550μl——末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（10）試劑2、標(biāo)記溶液5550μl——含有核苷酸混合液的反應(yīng)液（1）試劑3、轉(zhuǎn)化劑POD3.5ml——酶標(biāo)記抗熒光素抗體（即用型，融后4℃保存）二、所需的溶液和儀器

7、10mMTrisHCl（pH7.4~7.8）、PK配制、DAB、飯盒、吹風(fēng)機(jī)、3%H2O2甲醇溶液、PBS、蓋玻片、中性樹膠、蘇木素、二甲苯和無水乙醇（用量多）、雙蒸水（用以配梯度酒精）1充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60度20min，石蠟切片于染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min5；②3%過氧化氫甲醇中浸洗1015min，抑制內(nèi)源性過氧化氫酶。③用蛋白酶K（20μgml溶于TrisHC

8、l中，pH7.4~8.0）室溫孵育15~30分鐘。④PBS洗約5min2次，擦干樣品周圍的水。此階段配制TUNEL反應(yīng)混合物——從試劑2中取出100μl標(biāo)記溶液作為兩個(gè)陰性對(duì)照；將試劑1中取5μl試劑2中45μl標(biāo)記液中，配成50μlTUNEL反應(yīng)混合物混勻（即配即用，4℃避光?。輼?biāo)記反應(yīng)：滴加50μl的TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60分鐘（為防蒸發(fā)和保證TUNEL反應(yīng)混合物均勻分布，可以在孵育過程中加蓋蓋玻片）。PBS洗

9、5min3次，至此樣品可在熒光鏡下（綠色）分析結(jié)果。⑥信號(hào)轉(zhuǎn)化和分析：擦干樣品周圍的水分，加入50ul轉(zhuǎn)化劑POD，濕盒中37℃孵育20~30分鐘（可以在孵育過程中加蓋蓋玻片）。PBS洗5min3~5次⑦加入50~100μlDAB底物溶液，室溫（10~25℃）孵育5~10min，PBS洗5min3次。（蘇木素染13秒，以免視野全染，需要摸索條件）⑧中性樹膠或者甘油封片（在封片前可以復(fù)染），光鏡下分析結(jié)果。?穩(wěn)定性：TUNEL反應(yīng)混合物需

10、在使用前立即制備，不能儲(chǔ)存，配好的此液體必須將放入冰浴中。2、轉(zhuǎn)化劑POD（即用型）：一旦融化此液體，需在4℃保存（最多保存6個(gè)月），并且不能反復(fù)凍存。蛋白酶K一般工作液濃度為20ugml但濃縮液可配制1~10mgml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100mMTrisHClPH8.050mMEDTA）；注意：1)蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長(zhǎng)孵育時(shí)間可能導(dǎo)致切片脫落（comeofftheslide）所以要最優(yōu)化孵育時(shí)間長(zhǎng)短。時(shí)

11、間一般為10~30min，4um左右的片子可以用10min，但30um左右的可用30min，最終通過摸索最佳時(shí)間。過長(zhǎng)易脫片、過短起不到通透效果。2)對(duì)于比較困難的組織，可以選用0.1MpH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行修復(fù)（石蠟切片無必要用），200ml需350W修復(fù)5min3)對(duì)照：陰性對(duì)照：經(jīng)過固定和通透的細(xì)胞樣品加入50μl試劑2以代替TUNEL反應(yīng)混合物，從標(biāo)記步驟以下同上。陽性對(duì)照：經(jīng)過固定和通透的細(xì)胞樣品用細(xì)球菌的核酸酶或DN

12、aseI使之產(chǎn)生DNA鏈缺口，從標(biāo)記步驟以下同上。4)操作流程：常規(guī)脫蠟、脫水處理——沖洗樣品——滴加TUNEL反應(yīng)混合物，37℃孵育60分鐘——沖洗樣品——選擇：熒光鏡下觀察分析——滴加轉(zhuǎn)化劑POD，37℃孵育30分鐘——洗樣品——滴加DAB底物溶液，室溫孵育520分鐘——光鏡下分析結(jié)果5)假陽性多的原因有很多：POD封閉不全、DAB顯色時(shí)間過長(zhǎng)等原因假陽性嚴(yán)重，可能原因應(yīng)該是DAB孵育時(shí)間過長(zhǎng)，建議首先排除之，同時(shí)加強(qiáng)PBS浸洗6)

13、DAB顯色時(shí)間:（1）DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；（2）DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；（3）此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；（4）DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵

14、育時(shí)間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長(zhǎng)。7)脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片:（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯(cuò)的，可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)。（2）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。（3）組織的問題，越是有壞死之類越容易脫。（4）沒烤好，時(shí)間短溫度不夠之類。（5）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑