細(xì)胞凋亡檢測

1、細(xì) 胞 凋 亡 檢 測,細(xì) 胞 凋 亡 概 念,是多細(xì)胞有機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì) 胞自主、有序的死亡過程 涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控 在生物體進(jìn)化、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、多系統(tǒng)發(fā)育等過程 中起著重要作用,細(xì) 胞 凋 亡 過 程,細(xì)胞凋亡的幾種檢測方法,形態(tài)學(xué)觀察：普通光鏡、熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡 磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 線粒體膜勢能的檢測 DNA片斷化檢

2、測：大分子染色體DNA片段、 DNA Ladder 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL） 半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性的檢測,形態(tài)學(xué)觀察,光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡：體積縮小、核深染、核碎裂、 凋亡小體形成、無炎癥反應(yīng)熒光顯微鏡和激光共聚

3、焦顯微鏡： DNA特異性染料 （ Hoechest 33342/33258, DAPI） 透射電子顯微鏡：超微結(jié)構(gòu)是診斷凋亡的最可靠指標(biāo),Annexin V法,磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）：細(xì)胞凋亡早期從內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面 Annexin V:鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，與PS可高親和力特異性結(jié)合,,Annexin V 與 PI聯(lián)合,碘化丙啶(propidine i

4、odide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。 已開發(fā)出多種熒光標(biāo)記的試劑盒,流式細(xì)胞儀分析,熒光顯微鏡結(jié)果,線 粒 體 膜 勢 能 檢 測,線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián) 反應(yīng)過程中較早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征

5、 （染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前 親脂性陽離子熒光染料（如Rhodamine 123、Dioc6、JC- 1、TMRM等）可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，流式細(xì)胞儀檢測 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度 不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變 化,,DNA 片 斷 化 檢 測,細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kb長

6、的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。,TUNEL,細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大 量的粘性3’-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 （TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化 物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的 3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測

7、 是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單 個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng) 細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,Caspase活性的檢測,在正常狀態(tài)下， Caspase家族都以無活性的酶原(30～ 50kD)形式表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)Caspase可以被蛋白酶 裂解，大亞基和小亞基形成活化的Caspase 。一些Caspase 活化后可以次序激活其他Ca

8、spase形成Caspase級聯(lián)反應(yīng)， 促發(fā)細(xì)胞凋亡。在目前已知的14種Caspase中， Caspase- 3、Caspase-8和Caspase-9與凋亡的關(guān)系最為密切，在細(xì) 胞凋亡中起執(zhí)行凋亡的作用。,相關(guān)基因表達(dá)的檢測,細(xì)胞凋亡時(shí)許多基因表達(dá)異常，檢測這些凋亡相關(guān)調(diào) 控基因的表達(dá)水平也成為檢測細(xì)胞凋亡的常用方法 Fas ；c-myc；Bcl-2 和bcl-X 表達(dá)水平比例

9、 方法：Northern雜交、PCR、Western Blot、免疫組化 Amplifluor? Apoptosis Gene Systems： 檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表 達(dá)水平,端 粒 酶 檢 測,端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身 RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得

10、 “永生化”。 作為有絲分裂的一種時(shí)鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或 細(xì)胞凋亡的信號 TRAP-eze Telemerase Detection Kit：在提供特定的寡 核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對的引 物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上 接上不同個(gè)數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復(fù)序列， 通過PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個(gè)堿基

11、 的DNA Ladder現(xiàn)象    這種檢測方法也不專對細(xì)胞凋亡，檢測結(jié)果也不純反 應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)檢測,谷胱苷肽(GSH)是細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑 許多細(xì)胞的細(xì)胞膜中有可被凋亡信號啟動(dòng)的ATP依賴的 GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 熒光染料MCB體外檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷胱苷肽的減 少來檢測凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧

12、化還原狀態(tài)的變化 HeLa 和3T3細(xì)胞等凋亡時(shí)沒有明顯的GSH水平變化，不能 用此法檢測,細(xì)胞色素C的定位檢測,凋亡信號刺激可使細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié) 合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟 動(dòng)caspase級聯(lián)反應(yīng) 細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase

13、 subunit Ⅳ：COX4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白， 凋亡發(fā)生時(shí)，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集 部分的一個(gè)非常有用的標(biāo)志 ApoAlertTMCell Fractionation Kit（Clontech）,流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡的分析,線粒體功能 Annexin V Assay Caspases DNA Fragmentation Assays