基因重組和雜交育種培訓(xùn)課程

1、基因重組和雜交育種培訓(xùn)課程,,第三節(jié) 基因重組和雜交育種,凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過(guò)遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組（gene recombination）或遺傳重組（genetic recombination），簡(jiǎn)稱重組。,細(xì)胞水平的雜交包含分子水平上的重組。,基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。在方向性還是自覺性方面，比誘變育種前進(jìn)了一大步。且可消除某一菌株在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)

2、量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。,一、原核生物的基因重組,原核生物的基因重組形式很多，機(jī)制較原始。,特點(diǎn)：① 片段性，僅一小段DNA序列參與重組；② 單向性，即從供體菌向受體菌（或從供體基因組向受體基因組）作單方向轉(zhuǎn)移；③ 轉(zhuǎn)移機(jī)制獨(dú)特而多樣，如接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等。,受體菌（recipient cell，receptor）直接吸收供體菌（donor cell）的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化

3、作用。,通過(guò)轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱轉(zhuǎn)化子（transformant）。,（一）轉(zhuǎn)化（transformation） 1. 定義,自然遺傳轉(zhuǎn)化（natural genetic transformation）,人工轉(zhuǎn)化（artificial transformation）,,原核生物Streptococcus pneumoniae（肺炎鏈球菌）、Haemophilus（嗜血桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、N

4、eisseria（奈瑟氏球菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Xanthomonas（黃單胞菌屬）等。,2. 轉(zhuǎn)化微生物的種類,真核微生物Saccharomy cescerevisiae（釀酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脈孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。,3. 感受態(tài)（competence）,感受

5、態(tài)是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。,研究發(fā)現(xiàn)，能發(fā)生轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞都處于感受態(tài)。,感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。,自然感受態(tài)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性，受細(xì)菌自身的基因控制；,人工感受態(tài)則是通過(guò)人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。（該過(guò)程與細(xì)菌自身的遺傳控制無(wú)關(guān)！）,感受態(tài)受遺傳控制，但也存在個(gè)體差異。感受態(tài)出現(xiàn)的時(shí)間不

6、同；感受態(tài)細(xì)胞所占比例和維持時(shí)間不同；外界環(huán)境因子如腺苷酸（cAMP）及Ca2＋等對(duì)感受態(tài)也有重要影響。,調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白稱感受態(tài)因子。,膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白（membrane-associated DNA binding protein）,細(xì)胞壁自溶素（autolysin）,幾個(gè)核酸酶,,,4. 轉(zhuǎn)化因子（transforming principle）,轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是離體的DNA片段。一般只有15kb左右。,在不同的微生

7、物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同。良好的轉(zhuǎn)化因子有dsDNA（最宜于細(xì)胞表面結(jié)合）、ssDNA和質(zhì)粒DNA，通常不能與核染色體組發(fā)生重組。,轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.1％～1.0％，最高為20％。能發(fā)生轉(zhuǎn)化的最低DNA濃度極低，為化學(xué)方法無(wú)法測(cè)出的1×10－5mg／mL（即1×10－11g／mL ）。,,5. 轉(zhuǎn)化過(guò)程,（1）自然遺傳轉(zhuǎn)化（簡(jiǎn)稱自然轉(zhuǎn)化）,1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcus p

8、neumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化過(guò)程研究得較深入的就是這種G＋細(xì)菌。,目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力,進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：,①建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞,②外源游離DNA分子,枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化過(guò)程（革蘭氏陽(yáng)性菌的轉(zhuǎn)化模型）,,strR，存在抗鏈霉素的基因標(biāo)記,strS，有鏈霉素敏感型基因標(biāo)記,自然轉(zhuǎn)化過(guò)程的特點(diǎn)：,a）對(duì)核酸酶敏感；,c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）供體菌和受體

9、菌之間的親源關(guān)系；,d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多；,b）不需要活的DNA給體細(xì)胞；,提高質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率的二種方法：1）使質(zhì)粒形成多聚體，這樣進(jìn)入細(xì)胞后重新組合成有 活性的質(zhì)粒的幾率大大提高；2）在質(zhì)粒上插入受體菌染色體的部分片段，或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)含有與該質(zhì)粒具有同源區(qū)段的質(zhì)粒的受體菌——重組獲救。,（2）人工轉(zhuǎn)化,用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。,在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基

10、因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。,不是由細(xì)菌自身的基因所控制；,用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。,質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高；,指用提純的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主細(xì)胞或其原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。,6. 轉(zhuǎn)染（transfection）,噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒,現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞的過(guò)程也稱轉(zhuǎn)染,提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的

11、（而非感染）途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。,特點(diǎn)：,（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,通過(guò)缺陷噬菌體（defective phage）的媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，就稱轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。,由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式：一個(gè)細(xì)胞的DNA通過(guò)病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中,能將

12、一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。,細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo),局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),,流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo),完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo),,1.普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transduction）,通過(guò)極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌任何小片段DNA進(jìn)行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。,一般用溫和噬菌體作為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介。,（1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo),簡(jiǎn)稱普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)或完全轉(zhuǎn)導(dǎo)（complete tran

13、sduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)嗜菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源DNA在其內(nèi)進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，使其成為一個(gè)遺傳性狀穩(wěn)定的重組體，稱作普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子，這種現(xiàn)象就稱普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。,Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）的野生菌株,Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株,P22嗜菌體,供體菌,受體菌,,轉(zhuǎn)導(dǎo)模型,供體菌,受體菌,,,轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介—嗜菌體,,誤包,轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒

14、,,普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子,雙交換,同源配對(duì),10-6～10-8,S.typhimurium的P22噬菌體、E.coli的P1噬菌體、Bacillus subtilis的PBS1和SP10等噬菌體都能進(jìn)行完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。,供體菌轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介——嗜菌體受體菌,,（2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo),簡(jiǎn)稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortive transduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)嗜菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源DNA在其內(nèi)既不進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，也不迅速消

15、失，而僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)，這種現(xiàn)象就稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。,受體菌,,外源DNA,,細(xì)胞分裂,外源基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯而形成的少量酶,,獲得外源DNA,獲得少量酶,不斷稀釋,特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落,DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA，而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：,進(jìn)入受體的外源DNA通過(guò)與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。,,流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortive transduc

16、tion）,,轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。,,特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落,外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。,,DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA，而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。,2.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（specialized transduction， restricted transduction）,指通過(guò)部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者

17、的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。 最初于1954年在E. coliK12中發(fā)現(xiàn)。,特點(diǎn)：① 只局限于傳遞供體菌核染色體上的個(gè)別特定基因，一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因；② 該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；③ 缺陷噬菌體的形成方式是由于它在脫離宿主染色體過(guò)程中，發(fā)生低頻率（～10-5）“誤切”（不正常切離，abnormal excesion）或由于雙重溶源菌的裂解而形成；④ 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過(guò)UV等因素對(duì)

18、溶源菌的誘導(dǎo)并引起裂解后才產(chǎn)生。,局限轉(zhuǎn)導(dǎo),低頻轉(zhuǎn)導(dǎo),高頻轉(zhuǎn)導(dǎo),,根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子出現(xiàn)頻率的高低分類,溫和噬菌體感染,,整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化,,溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上,部分缺陷的溫和噬菌體,,把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中,,缺陷噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的λDNA分子一樣進(jìn)行復(fù)制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。但沒有正

19、常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細(xì)胞后，通過(guò)DNA整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。,E. coli的λ嗜菌體和φ80嗜菌體具有局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。,3.溶源轉(zhuǎn)變（lysogenic conversion）,正常的溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主核基因組上，而使宿主獲得了除免異性外的新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉(zhuǎn)變。,一個(gè)與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象,溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同？,a）這是一種不攜帶任何外源基因的正常時(shí)

20、菌體；,b）是嗜菌體的基因內(nèi)而不是供體菌的基因提供了宿主的信性狀；,,c）新性狀是宿主細(xì)胞溶源化時(shí)的表型，而不是經(jīng)遺傳重組形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子；,d）獲得的性狀可隨嗜菌體的消失而同時(shí)消失；,（三）接合（conjugation，mating）,供體菌（“雄性”）通過(guò)性菌毛與受體菌（“雌性”）直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長(zhǎng)度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過(guò)接合而獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，就是接合子（c

21、onjugant）。,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm細(xì)菌的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn),通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過(guò)程,中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！,大腸桿菌的接合機(jī)制,接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo),F因子的分子量通常為5×107，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛（sex pili）及控制接合過(guò)程進(jìn)行的20多個(gè)基因。,

22、含有F因子的細(xì)胞：“雄性”菌株（F+），其細(xì)胞表面有性菌毛,不含F(xiàn)因子的細(xì)胞：“雌性”菌株（F-），細(xì)胞表面沒有性菌毛,F因子為附加體質(zhì)?？擅撾x染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，可插入（整合）到染色體上,F因子的四種細(xì)胞形式,a）F-菌株， 不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過(guò)接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；,b）F+菌株， F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。,c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。,d）F′菌株

23、，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)， 形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。 細(xì)胞表面同樣有性菌毛。,（四）原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）,通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定的重組子的過(guò)程，稱為原生質(zhì)體融合。由此法獲得的重組子，成為融合子（fusant）。,選擇兩個(gè)有特殊價(jià)值的并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本,脫壁酶,細(xì)菌或放

24、線菌可用溶菌酶或青霉素處理，真菌可用蝸牛酶或其他相應(yīng)的脫壁酶等,離心聚集,在高滲溶液中稀釋,加入促融合劑或電脈沖,各種選擇性培養(yǎng)基,原生質(zhì)體融合的主要步驟是：,原生質(zhì)體融合的重組頻率已大于10-1（而誘變育種一般僅為10-6）；同種的不同菌株間或種間進(jìn)行融合，屬間、科間甚至更遠(yuǎn)緣的微生物或高等生物細(xì)胞間的融合，以期達(dá)到生產(chǎn)性狀更為優(yōu)良的新物種。,二、真核微生物的基因重組,有性雜交,準(zhǔn)性雜交,原生質(zhì)體融合,遺傳轉(zhuǎn)化,,（一）有性雜交

25、（sexual hybridization）,雜交是在細(xì)胞水平上發(fā)生的一種遺傳重組方式。有性雜交，一般指不同遺傳型的兩性細(xì)胞間發(fā)生的接合和隨之進(jìn)行的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。,（二）準(zhǔn)性雜交（parasexual hybridization）,準(zhǔn)性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種兩性生殖方式，這是一種在同種而不同菌株的體細(xì)胞間發(fā)生融合，它可不借減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。,準(zhǔn)性生殖過(guò)程：

26、（1）菌絲聯(lián)結(jié)（anastomosis） （2）形成異核體（heterocaryon） （3）核融合（nuclear fusion）或核配（caryogamy） （4）體細(xì)胞交換（somatic crossing-over）和單倍體化,準(zhǔn)性雜交育種（breeding by parasexuality）：① 選擇親本：選擇來(lái)自不同菌株的合適的營(yíng)養(yǎng)缺陷型作為準(zhǔn)性雜交的親本。② 強(qiáng)制異合：用人為的方法強(qiáng)制兩菌株形成異核體。 ③ 移