源自太湖的兩株溶藻細菌及其溶藻機制的研究.pdf

1、近年來，淡水湖泊富營養(yǎng)化嚴重，藍藻水華頻繁爆發(fā)，嚴重影響了淡水資源的有效利用，已經(jīng)成為一個全球性的問題。中國的第三大淡水湖太湖（面積：2338km2）也不例外。太湖不僅為流域的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了寶貴的淡水，而且是沿岸城鎮(zhèn)居民的重要飲用水水源。太湖流域位于長三角地帶，人口密集，是中國經(jīng)濟最發(fā)達的地區(qū)之一。近些年來，富含氮、磷的工農(nóng)業(yè)污水的排放引起了太湖水體嚴重的富營養(yǎng)化，進而導致了以銅綠微囊藻為最優(yōu)勢藻種的太湖藍藻水華的頻繁和大規(guī)模爆發(fā)。藍

2、藻水華的頻繁爆發(fā)嚴重影響了太湖流域社會經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展，也嚴重威脅到了流域居民的身體健康和飲用水安全。當前，用于水華防控的物理和化學手段，由于費用成本高，而且容易造成二次污染，因而它們的廣泛應用受到了挑戰(zhàn)。藍藻水華的生物防控因其具有靶向性和環(huán)境友好性等優(yōu)點而被視為控制藍藻水華的很有發(fā)展?jié)摿Φ挠行侄?。尤其是，溶藻細菌已被證實在水華消退過程中起著重要的作用，溶藻細菌在今后水華防控中將具有很好的應用前景。
　　隨著藻菌互作研究的深入，

3、一些溶藻菌及其溶藻物質(zhì)已經(jīng)被分離和鑒定出來，并被證明是有效溶藻的。但是，對這些溶藻化合物在溶藻過程中的相互作用機制，以及溶藻細菌在溶藻化合物合成過程中的調(diào)控機制仍然不清楚。篩選更加高效的溶藻細菌、分離鑒定相應溶藻物質(zhì)，并對溶藻化合物在溶藻過程中的相互作用機制，以及溶藻細菌在溶藻化合物合成過程中的調(diào)控機制進行深入的研究，有助于設計新的、有效的防控藍藻藻華的策略。
　　本研究從太湖嚴重富營養(yǎng)化的梅梁灣水域的藍藻水華中，分離出了17株對

4、源自太湖水華的銅綠微囊藻9110具有較好溶藻效果的溶藻細菌。經(jīng)16S rRNA測序鑒定，這17株溶藻細菌主要集中在金黃桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、叢毛單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬、微小桿菌屬。它們多數(shù)為革蘭氏陰性細菌。
　　金黃桿菌GLY-1106對銅綠微囊藻9110具有最強的溶藻活性（六天溶藻率達98.8%）。研究發(fā)現(xiàn)，該菌不僅對微囊藻具有強的溶藻活性，而且對顫藻、綠藻、衣藻等其它藻也具有較好的溶藻效果（六天的溶藻率高

5、于90%），說明金黃桿菌GLY-1106溶藻譜較廣。金黃桿菌GLY-1106的溶藻模式是間接的，主要通過分泌胞外熱穩(wěn)定的溶藻活性物質(zhì)進行溶藻。采用乙酸乙酯萃取，硅膠柱色譜、高效液相色譜等技術從金黃桿菌GLY-1106發(fā)酵液中分離、純化出了兩個對銅綠微囊藻具有溶藻活性的物質(zhì)，并綜合應用超高效液相色譜高分辨電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術、氣相色譜電子轟擊離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術和核磁共振技術等解析了溶藻物質(zhì)的化學結(jié)構。金黃桿菌GLY-1106的兩個溶藻

6、物質(zhì)分別是：7-羥基-3-異丁基-六氫-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（簡稱：環(huán)(4-羥基-脯氨酸-亮氨酸)，cyclo(4-OH-Pro-Leu)）和六氫-3-(2-甲基丙基)-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（簡稱：環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)，cyclo(Pro-Leu)）。cyclo(4-OH-Pro-Leu) 和cyclo(Pro-Leu)對銅綠微囊藻9110的半數(shù)有效濃度分別為1.26和2.70μg ml-1。<

7、br>　　通過組合實驗發(fā)現(xiàn)，金黃桿菌 GLY-1106所分泌的cyclo(4-OH-Pro-Leu)與cyclo(Pro-Leu)之間存在協(xié)同溶藻效應。實驗發(fā)現(xiàn)，cyclo(4-OH-Pro-Leu)主要破壞藍藻細胞的光合系統(tǒng)，中斷藍藻光合系統(tǒng)中光合電子的傳遞；cyclo(Pro-Leu)主要抑制藻細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性。進一步在細胞水平從氧化還原穩(wěn)態(tài)的角度解析了兩種溶藻物質(zhì)之間的協(xié)同機制：兩種溶藻物質(zhì)的組合使用使藍藻細胞的光合能力和

8、抗氧化酶活性同時被抑制，加速了氧化還原穩(wěn)態(tài)的失衡，導致了細胞內(nèi)活性氧水平的更快上升和氧化損傷（如：脂質(zhì)過氧化）（實驗結(jié)果也顯示了這個變化）；另外，較高的活性氧水平可能進一步加速了抗氧化酶活性和光合能力的下降，進而導致藍藻細胞內(nèi)活性氧水平的更大幅度上升以及更大程度的氧化損傷（實驗結(jié)果也顯示了這個變化），最終導致藍藻細胞死亡、裂解。
　　群體感應是一種細胞濃度依賴的細菌細胞之間的信息交流機制，對細菌許多的代謝功能和行為起著重要的調(diào)控作

9、用。革蘭氏陰性細菌中最常見的群體感應信號分子為氮酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHL）。前期研究顯示，群體感應系統(tǒng)可能在溶藻細菌細胞內(nèi)合成溶藻物質(zhì)的過程中起著一定的調(diào)控作用。為了進一步確證群體感應系統(tǒng)在溶藻細菌合成溶藻物質(zhì)過程中的可能調(diào)控作用及相應調(diào)控機制，本研究采用AHL的生物傳感器菌株紫色色桿菌CV026從17株溶藻細菌中篩選產(chǎn)AHL的菌株。研究發(fā)現(xiàn)具有最高溶藻活性的金黃桿菌GLY-1106不產(chǎn)生可檢測的AHL。產(chǎn)生AHL的溶藻菌株主要集中在氣

10、單胞菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、鞘氨醇桿菌屬。氣單胞菌GLY-2107在產(chǎn)AHL的溶藻菌株中具有最高的溶藻活性，因此對其進行了進一步的研究。
　　研究發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌 GLY-2107具有較寬的溶藻譜，該菌不僅對微囊藻具有強的溶藻活性，而且對顫藻、綠藻、衣藻等其它藻也具有較好的溶藻效果（六天的溶藻率高于90%）。氣單胞菌GLY-2107的溶藻模式是間接的，主要通過分泌胞外熱穩(wěn)定的溶藻活性物質(zhì)進行溶藻。采用乙酸乙酯萃取，硅膠柱色譜和

11、高效液相色譜等技術從氣單胞菌 GLY-2107發(fā)酵液中分離、純化出了兩個對銅綠微囊藻具有溶藻活性的物質(zhì)，并綜合應用超高效液相色譜高分辨電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術、氣相色譜電子轟擊離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術和核磁共振技術等解析了溶藻物質(zhì)的化學結(jié)構。氣單胞菌 GLY-2107的兩個溶藻物質(zhì)分別是：3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮（簡稱：環(huán)(甘氨酸-苯丙氨酸)，cyclo(Gly-Phe)）和3-甲基吲哚。3-甲基吲哚和cyclo(Gly-Phe)對銅綠

12、微囊藻9110的半數(shù)有效濃度分別為1.10和4.72μg ml-1。
　　綜合應用反相薄層層析-AHL生物傳感器菌株檢測技術、高效液相色譜四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術鑒定了氣單胞菌GLY-2107的AHL指紋。氣單胞菌GLY-2107產(chǎn)兩種AHL，分別為丁酰高絲氨酸內(nèi)酯（C4-HSL）和己酰高絲氨酸內(nèi)酯（C6-HSL）。通過對AHL合成酶基因及相應的受體基因敲除、并對AHL合成酶缺陷菌株進行化學回補、及對AHL受體基因缺陷菌株進