環(huán)境溶藻細菌的檢測與評價.pdf

1、我國富營養(yǎng)化湖泊的比例達到60％，太湖、滇池等重要水源水體在夏秋季節(jié)頻繁爆發(fā)藍藻水華，嚴重影響了當?shù)厝嗣裆詈凸まr(nóng)業(yè)發(fā)展。在各種理化手段治理效果不甚理想的情況下，微生物除藻技術(shù)已經(jīng)越來越受到研究者的關(guān)注。溶藻細菌在此技術(shù)中起著重要的作用。本課題旨在建立分子生物學方法分析、檢測環(huán)境溶藻細菌，并對太湖土著溶藻細菌進行分離與除藻效果的初步評價，為微生物除藻技術(shù)的構(gòu)建和應用提供科學依據(jù)。 本文分四個部分進行闡述： 1.環(huán)境溶

2、藻細菌PCR定性檢測法的建立 假單胞菌屬是較為常見的環(huán)境溶藻細菌。本研究根據(jù)假單胞菌屬16SrRNA基因序列設計特異性引物，應用PCR技術(shù)擴增目標細菌。針對PCR反應條件中的Mg2+、dNTP、引物、Taq酶，應用正交試驗設計確定了假單胞菌屬特異性引物PCR擴增的最佳反應體系：反應總體積為20μL，含DNA70～100ng、dNTP300μM、上下游引物各10pm、Mgcl21.0mM、Taq酶1.5個單位、10×Reacti

3、onBuffer2.5μL。熱循環(huán)條件為：95℃，5min；30個循環(huán)，92℃，1min；64.1℃，1min；72℃，1min；72℃，延伸10min。得到990bp的特異性條帶，此方法能夠快速檢測出環(huán)境樣本中的目標菌屬，最低檢測限為3.0ngDNA。 2.環(huán)境溶藻細菌RTQ-PCR定量檢測法的建立 本研究應用SYBRGreenⅠ標記技術(shù)，與上章的最佳PCR條件相結(jié)合，建立了實時熒光定量檢測假單胞菌屬在環(huán)境中的相對

4、豐度的RTQ-PCR方法。該方法對總細菌的檢測范圍為103～108個基因拷貝/μL(R2=0.997)，假單胞菌屬的檢測范圍為1～105個基因拷貝/μL(R2=0.994)?？偧毦c假單胞菌屬初始拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系曲線表達式分別為：Ct(USU)=-3.9081LgCopynumber+46.0741，Ct(PSE)=-3.265LgCopynumber+22.6789。應用該方法定量檢測太湖水樣及南京市污水處理廠活性污泥等環(huán)

5、境樣本中假單胞菌屬的豐度，證明此方法在檢測環(huán)境樣本中假單胞菌屬豐度的可行性。 3.溶藻細菌PCR檢測法在太湖水除藻研究中的應用 應用以上建立的常規(guī)PCR技術(shù)以及RTQ-PCR技術(shù)，分別對懸掛于太湖梅梁灣水域的除藻中試裝置中三種人工介質(zhì)富集的總細菌基因組DNA進行定性、定量分析。常規(guī)PCR技術(shù)對8月份三種介質(zhì)定性分析發(fā)現(xiàn)，材料上富集大量的假單胞菌屬；實時熒光定量PCR對5-10月間三種介質(zhì)定量分析發(fā)現(xiàn)，三種介質(zhì)上目標細

6、菌豐度分別為組合填料：0.84％、無紡布填料：0.58％、彈性填料：0.35％，其對假單胞菌的富集能力由強至弱為組合填料＞無紡布填料＞彈性填料。在α=0.05的水平上各個裝置中間縱面的細菌豐度高于進水及出水縱面，后兩者在統(tǒng)計學上無明顯的差異。每個縱面上，表面采樣點及底部采樣點上細菌的豐度低于中部采樣點。 4.溶藻細菌的分離及其評價 從太湖監(jiān)藻水華爆發(fā)時分離獲得了銅綠微囊藻，并經(jīng)高效液相色譜對其產(chǎn)毒量進行分析。結(jié)果表明

7、，當藻細胞起始濃度為7.8×106個/mL，采樣間隔為8小時，四個時間點每106個藻細胞的MC-LR產(chǎn)毒素量分別為0.3523μg、0.3047μg、0.2815μg、0.2271μg。于梅梁灣水域放置的除藻中試裝置的人工介質(zhì)上分離出一株溶藻細菌，經(jīng)形態(tài)學、生理與生化特性、以及16SrRNA特異性引物擴增綜合分析，初步鑒定該株菌屬于假單胞菌屬；該菌對源自太湖的銅綠微囊藻具有較強的溶藻作用。其最低溶藻濃度為105個/mL。在太湖水、PBS

8、以及BG11培養(yǎng)基等不同反應體系內(nèi)，當藻細胞初始濃度為7.8×106個/mL，投加菌液濃度為106個/mL時，該菌24小時藻細胞溶解率分別為85.9％，67.9％和91.0％，完全溶藻時間為48小時；該株細菌在去除微囊藻細胞的同時，對MC-LR具有較強的降解作用。在微囊藻毒素LR起始濃度為2.6423μg/L的條件下，該細菌對MC-LR在作用18、36和72小時后的降解率分別為14.2％，51.3％和100.0％。由此為今后將該菌應用于