腫瘤細胞生物學

1、怎 么 樣 學？,熟悉細胞生物學知識,參考教材：細胞生物學（第二版）鄭國錩，1992，高等教育出版社 細胞生物學（第二版）汪堃仁等,1998，北京師范大學出版社 細胞生物學（第三版）翟中和等，2007，高等教育出版社,對比著學,關注前沿 學術期刊（中國期刊網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、Google直接搜索等）； 生物論壇（生物通、丁香園、生命科學論壇等）,

2、前 言,1. 細 胞 生 物 學？,細胞生物學是研究細胞結構、功能及生活史的一門科學。,現(xiàn)代細胞生物學從顯微水平，超微水平和分子水平等不同層次研究細胞的結構、功能及生命活動（基因調控、信號轉導、腫瘤生物學、細胞分化和凋亡是當代的研究熱點）。,1953年DNA雙螺旋結構的提出，1958年生物學中心法則的建立明確了細胞最本質問題是自我復制（ self-replication ），這些科學的發(fā)現(xiàn)把當時從細胞形態(tài)結構研究而引申出的“細胞學”推

3、向了一個更高階段，“細胞生物學”應運而生。,2.細胞生物學發(fā)展史上的重大事件,諾貝爾獎,連續(xù)多年的諾貝爾獎內容幾乎都在細胞生物學范圍內,2001年生理醫(yī)學獎：細胞周期調控機理 2002年生理學或醫(yī)學獎：器官發(fā)育的遺傳 調控和細胞程序性死亡2003年化學獎：細胞膜水通道，離子通道結構和機理2006年生理學或醫(yī)學獎：RNA干擾機制；化學獎：捕捉DNA的復制過程,2007年生理醫(yī)學獎：利用小鼠胚胎干細胞進行基因打靶200

4、9年生理醫(yī)學獎：端粒酶 (telomerase)；化學獎：核糖體的結構和作用的研究2010年生理學或醫(yī)學獎：通過體外受精治療多種不育癥,細胞生物學已經成為當代生物科學中發(fā)展最快的一門尖端學科，在我國基礎學科發(fā)展規(guī)劃中，細胞生物學與分子生物學，神經生物學和生態(tài)學并列為生命科學的四大基礎學科。,3.為什么說細胞生物學是現(xiàn)代生命科學的重要基礎學科?,重大前沿課題的解決，如生育的控制、腦的奧秘、腫瘤的防治、器官移植、免疫反應、新藥研制、心腦

5、血管疾病及艾滋病防治直至延年益壽等等，都離不開細胞生物學的研究。,4. 腫瘤細胞生物學？,從細胞和分子水平上對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉移等過程進行研究的學科。,DNA 損傷檢控系統(tǒng)信號傳導、細胞周期檢控系統(tǒng)功能失調與腫瘤發(fā)生的關系；腫瘤細胞增殖分化與凋亡過程及其調控機理；腫瘤血管生成分子機理及其與腫瘤后期發(fā)展的關系。,具體研究內容：,本章內容,腫瘤細胞生物學,腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移,細胞分化、凋亡和腫瘤,形態(tài)特征,生理特征

6、,細胞核,細胞質,細胞膜,,,,第一節(jié) 腫瘤細胞的形態(tài)特征,一、 正常細胞的基本結構,正常細胞的基本結構圖,細胞核（nucleus）：是細胞內最重要的細胞器，核表面是由雙層膜構成的核被膜（nuclear envelope）；核內1至數(shù)個小球形結構，稱為核仁（nucleolus）；核內包含有染色質(chromatin）。。細胞核還具有核孔（nuclear pore）。,,,細胞質（cytoplasm）：質膜與核被膜之間的原生質。,質膜

7、（plasma membrane）：是細胞表面的單位膜。,,細胞器(organelle)：具有特定形態(tài)和功能的顯微或亞顯微結構稱為細胞器,,,,,,細胞質基質（cytoplasmic matrix）細胞質中除細胞器以外的部分。,二、 腫瘤細胞的形態(tài)特征,1.細胞核,,細胞器胞質顆粒,,糖蛋白糖脂膜表面抗原凝集素受體,,染色體核仁組織區(qū)端粒,2. 細胞質,3.細胞膜,1. 細胞核異常與腫瘤,（1）基本特征,人喉癌hep-2細胞

8、，瑞氏染色,出現(xiàn)巨核、雙核或多核，染色體呈不均一狀態(tài),正常分化細胞,癌細胞,核質比顯著高于正常細胞，可達1:1，正常的分化細胞僅為1:4-6,（2） 染色體,基本結構,組成：DNA、組蛋白、非組蛋白、少量RNA,核小體及螺線管的結構,染色體異常與腫瘤,染色體數(shù)目異常,人類細胞正常染色體,癌性胸腹水的染色體數(shù),染色體結構異常,ph染色體（費城1號染色體）:9號和22號染色體長臂易位 。 易位使9號染色體長臂（9q34）上的原癌基因

9、abl和22號染色體(22q11)上的bcr(break point cluster region)基因重新組合成融合基因。后者具有增高了的酪氨酸激酶活性，這是慢性粒細胞性白血病的發(fā)病原因。ph的重要臨床意義在于：大約95％的慢性粒細胞性白血病病例都是ph陽性，因此它可以作為診斷的依據(jù)。,,,腫瘤常見的染色體異常,基因突變與腫瘤：“二次突變學說”-（RB基因）,非遺傳性和遺傳性RB功能喪失的機理,（3）染 色 體 的 相 關 術 語,（

10、4）核仁組織區(qū)：nucleolar organizing regions, NORs,核糖體RNA基因所在的區(qū)域，其精細結構呈燈刷狀。能夠合成核糖體的28S、18S和5.8S rRNA。核仁組織區(qū)位于染色體的次縊痕區(qū)，但并非所有的次縊痕都是NORs。,NORs功能：編碼rRNA,NORs中心形成核仁,NORs與腫瘤,核仁組織區(qū)嗜銀蛋白（AgNOR）：判別細胞核中rDNA轉錄活性的一個指標，可通過測定核仁銀染面積與核面積的比值說明其嗜銀的

11、強度，區(qū)分腫瘤良、惡性病變或判斷腫瘤預后的指標。,胸腔積液中的惡性細胞-核仁組成區(qū)嗜銀蛋白染色 惡性腫瘤中AgNOR顆粒明顯增多且大小形態(tài)不規(guī)則性,（4）端粒和端粒酶,2009年生理醫(yī)學獎,三位美國科學家Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W.因在端粒和端粒酶如何保護染色體方面的發(fā)現(xiàn)而獲獎。,解決的生物學中的一個重大問題——細胞分裂期間染色體如何被完整復制，以及染色體如何得到保護

12、不至退化。 如果端粒變短，細胞就會衰老。相反，如果端粒酶活性很高，端粒長度就會維持，細胞衰老就會延遲，在癌細胞中就是這種情形，可被認為具有永生。,染色體端部的特化部分,端粒的結構,端粒由高度重復的短序列串聯(lián)而成，在進化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相似,保護染色體完整性和維持染色體的穩(wěn)定性,端粒的功能,保護染色體不被核酶降解；不具端粒的染色體末端有粘性，會與其它片段相連或兩端相連而成環(huán)狀,維持細胞的復制能力,起細胞分

13、裂計時器的作用，端粒核苷酸復制和基因DNA不同，每復制一次減少50-100bp，其復制要靠具有反轉錄酶性質的端粒酶來完成，正常體細胞缺乏此酶，故隨細胞分裂而變短，細胞隨之衰老。,端粒酶最早是在四膜蟲(Tetrahymena)中發(fā)現(xiàn)的。1985年，Blackbaurn 和Greider發(fā)現(xiàn)人工合成四膜蟲端粒的DNA片段(TTGGGG)4，可被四膜蟲細胞抽提物中的一種活性物質加長，這種活性物質對熱、蛋白酶K和RNA酶都敏感。,端粒酶（tel

14、omerase）的發(fā)現(xiàn),一種能夠催化延長端粒末端的核糖核蛋白(RNP), 由RNA和相關蛋白組成。能夠以自身攜帶的RNA為模板, 逆轉錄合成端粒DNA并添加于染色體末端,從而維持端粒長度的穩(wěn)定。人端粒酶的RNA組分由450個核苷酸組成。,端粒酶的概念,端粒酶RNA模板序列,端粒酶的功能,經典測定方法： 組織勻漿 測定細胞提取物將端粒片段延長至引物3’端的能力,,端粒酶的活性測定,改進的測定方法,端粒重復序列擴增法（T

15、RAP）：PCR機制,TRAP-Ag染法檢測HeLa細胞端粒酶活性,共有四種染色法：同位素法、染色法、熒光法和ELISA法,地高辛摻入法：端粒DNA合成功能,細胞原位雜交檢測法： 檢測RNA和活性亞單位RNA,電化學發(fā)光擴增方法,基于磁珠和納米粒子的電化學發(fā)光擴增方法檢測端粒酶活性,hTR：人端粒酶RNA 端粒酶蛋白癌基因和抑癌基因細胞分化及細胞周期端粒長度,端粒酶的活性調節(jié),早期腫瘤診斷的標志物,癌組織中端粒酶的表達

16、特點：表達陽性率很高，除少數(shù)腫瘤外，陽性率均在80%以上。而癌旁組織和正常相應組織陽性率低于10%，為低水平表達在一些前侵襲性病變中端粒酶表達水平增加研究顯示端粒酶可預測腦膜瘤、急性髓性白血病和胃腸道癌癥的預后,端粒酶與腫瘤,端粒酶作為腫瘤標志物的優(yōu)點：直接高度特異性：靈敏度高： 3個惡性細胞,抗腫瘤治療,反義核苷酸反轉錄酶抑制劑細胞分化誘導劑核酶,老年性疾病、早衰、腦萎縮以及高血壓、動脈粥樣硬化、心肌細胞損傷、心力衰

17、竭等心血管疾病,端粒酶與其他疾病,美國《發(fā)現(xiàn)》雜志報道，從2007年開始，首個以端粒為靶標的TA-65營養(yǎng)補充片劑就能夠從醫(yī)生那里買到，預計具有延緩衰老作用的藥物可在15年內獲得美國食品和藥物管理局（FDA）的批準。不過，這類抗衰老藥的致癌風險也不容忽視。 制藥商T.A.科學公司表示，他們的TA-65片劑能夠提高人體的骨密度和免疫能力，對于與衰老相關的生物標記物也有一定的作用，服用了這種片劑的人報告說，他們的運動、視覺和認知能

18、力都有所增強。但是，旨在延緩老化的端粒酶激活療法也可能增加罹患癌癥的幾率。有研究表明，提升小鼠體內端粒酶的活性，會使它們更容易患上皮膚癌和乳腺癌。,2.細胞質異常與腫瘤,（1）細胞器的改變,線粒體表現(xiàn)為不同的多形性、腫脹、增生,腎上腺皮質腺癌細胞中長形巨大線粒體 。×16000,甲狀腺癌細胞中有的線粒體（黑“↑”）呈S型或分叉型，其余仍為圓形及卵圓形。×20000,鼻咽癌細胞中有巨大畸形線粒體（黑“↑”）。×

19、;60000,滑膜肉瘤細胞中圈狀線粒體（黑“↑”）。×60000,鼻咽癌癌細胞，胞質中增生有大量線粒體（黑“↑”）。×25000,大鼠敗血癥模型肝細胞中線粒體（黑“↑”）腫脹，水腫，嵴結構不清。×20000,線粒體與腫瘤,mtDNA突變導致腫瘤擴散,與致癌物結合：mtDNA 對脂溶性化學物質非常敏感，并往往成為親電子物質首選的靶點，具有嗜脂性的致癌物往往優(yōu)先在mtDNA上聚集,線粒體DNA（mtDNA）突變

20、導致細胞氧化應激和細胞凋亡抑制從而誘導腫瘤發(fā)生,mtDNA突變的非隨機分離引起惡性轉化,mtDNA分子及其片段在核基因組中整合：通過引起核基因組的不穩(wěn)定性發(fā)生癌變；通過改變細胞能量產生，提高線粒體氧化壓力，引起線粒體酶表達異常和/或調控凋亡等途徑來影響細胞的生物學行為，使其發(fā)生惡變,核糖體的增加,無論正常組織或腫瘤組織，總核糖體合成增多是細胞增殖活躍的常見特征。,核糖體(ribosome)亦稱核蛋白體，由rRNA和80多種蛋白質組成。是

21、細胞合成蛋白質的重要場所。單核糖體有二個亞基，分別稱為大亞基和小亞基。,目前已經發(fā)現(xiàn)一些腫瘤抑制子和前癌基因可以影響核糖體成熟，通過改變蛋白質合成機器中的某些組分而誘導腫瘤的發(fā)生。,MYC（原癌基因產物）和PTEN（腫瘤抑制子）,原癌基因產物MYC和腫瘤抑制子PTEN通過對核糖體蛋白質轉錄和S6活性的調節(jié)表現(xiàn)出對核糖體生物合成的直接調節(jié)作用。,腫瘤抑制子PTEN也可以調節(jié)細胞體積的大小，并且也與核糖體的生物合成有關。PTEN 對S6是一

22、種負性調節(jié)，在許多腫瘤細胞中PTEN是突變的,c-MYC編碼轉錄因子，在一些B細胞特異的腫瘤和其它的幾種瘤形成中，c-MYC由于基因組異常而失調。,溶酶體明顯增多,溶酶體（lysosomes）真核細胞中的一種細胞器；為單層膜包被的囊狀結構，直徑約0.025～0.8微米；內含多種水解酶，專司分解各種外源和內源的大分子物質。1955年在鼠肝細胞中發(fā)現(xiàn)。,溶酶體與腫瘤的關系致癌物質引起細胞分裂調節(jié)機能的障阻及染色體畸變，可能與溶酶體釋放

23、水解酶的作用有關；某些影響溶酶體膜通透性的物質，如巴豆油，某些去垢劑、高壓氧等，是促進致癌作用的輔助因子，也能引發(fā)細胞的異常分裂；在核膜殘缺的情況下，核膜對核的保護喪失，溶酶體可以溶解染色質，而引起細胞突變；溶酶體代謝過程中的某些產物是腫瘤細胞增殖的物質基礎；致癌物質進入細胞，在與染色體整合之前，總是先貯存在溶酶體中，這已為放射自顯影所證實。,內質網(wǎng),內質網(wǎng)在抑制腫瘤發(fā)生中扮演重要角色： 美國密歇根大

24、學、加州大學舊金山分校等機構的研究人員發(fā)現(xiàn)HRASG12V在癌癥發(fā)生中參與一種迅速的細胞周期停滯，這種停滯與ER的大面積真空和擴張有關 ，他們認為內質網(wǎng)是腫瘤控制的一個“守門員”的直接功能。,細胞器與抗腫瘤治療,線粒體治療,腫瘤細胞通過內吞方式攝入金納米棒，接著被轉運到內吞體和溶酶體，進而改變了溶酶體膜的通透性而被釋放到胞漿，然后靶向運輸?shù)骄€粒體，引起線粒體膜電位降低，最終導致腫瘤細胞的死亡。,與溶酶體相關的治療,高頻熱療：高熱使癌細胞

25、中溶酶體的活性升高，加速癌細胞的死亡,核糖體失活蛋白（Ribosome Inactiviting Proteins,RIPs）是一類重要的天然抗癌活性成份，廣泛存在于植物界，如蓖麻蛋白、天花粉蛋白、苦瓜蛋白等,與核糖體相關的治療,與內質網(wǎng)相關的治療,內質網(wǎng)酶——ENTPD5在原代人類腫瘤樣品，以及細胞系中，伴隨著AKT的增長而增加研究人員通過一系列實驗證明ENTPD5是PI3K/PTEN作用途徑中的一部分，因此能作為一種潛在的抗腫瘤治療

26、靶標。,（2）胞質顆粒的出現(xiàn),黑色素顆粒,淋巴結惡性黑色素瘤轉移,嗜酸性顆粒,食管顆粒細胞瘤，其細胞胞質豐富, 充滿嗜酸性顆粒，部分顆粒融合呈小球狀HE×400,3.細胞膜異常與腫瘤,（1）正常細胞膜結構,（1）腫瘤細胞膜結構異常,糖蛋白丟失或合成新的糖蛋白,糖脂減少或合成新的糖脂,膜表面新生抗原,腫瘤特異抗原（tumor specific antigen,TSA）,粘蛋白(胰腺癌、乳腺癌)、黑色素瘤抗原基因表達產物、乳腺癌抗

27、原基因表達產物、胃癌、肉瘤、非小細胞肺癌等抗原基因表達產物、p15基因(黑色素瘤)、原癌基因HER-2/neu(乳腺癌、卵巢癌)、融合蛋白p210(白血病)。 DNA病毒編碼的腫瘤特異性抗原有：猿猴空泡病毒40 （SV40）、人乳頭瘤病毒(宮頸癌)、EB病毒(免疫母細胞性淋巴瘤)、乙型肝炎病毒(肝癌)。RNA病毒中的人T細胞白血病病毒(HTLV-1)、突變的ras基因編碼蛋白(消化道腫瘤、膀胱癌、前列腺癌)、突變P53基因編

28、碼蛋白(一種抑癌基因產物，見于消化、泌尿、呼吸等多種腫瘤)等,腫瘤相關抗原（tumor associated antigen, TAA）,甲胎蛋白(AFP)：原發(fā)性肝細胞癌約70%以上AFP在400 μg/L以上，多逐漸升高，亦有不高于400μg/L，甚至在正常水平的患者 癌胚抗原(CEA)：結腸癌的標志物(60%～90%患者升高)，但以后發(fā)現(xiàn)胰腺癌(80%)、胃癌(60%)、肺癌(75%)和乳腺癌(60%)也有較高表達 糖蛋白

29、抗原(CA)50：許多惡性腫瘤患者血中皆可升高，如66.6%的肺癌、88.2%的肝癌、68.9%的胃癌、88.5%的卵巢或子宮頸癌、94.4%胰或膽管癌，其他如直腸癌、膀胱癌等皆有70%以上是升高的 CA125：82.2%卵巢癌、58%胰腺癌、32%肺癌，及其他非婦科腫瘤皆有不同程度的升高,凝集素受體分布改變,凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質），

30、故名凝集素。,常用的為植物凝集素（Phytoagglutin，PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina，ConA）、麥胚素（Wheat germ agglutinin，WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin，PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它們的總稱。,,,,,凝集素標記技術,凝集素受體為特異性的單糖或寡糖。人類的凝集素受體多位于細胞膜或細

31、胞器的膜上,凝集素受體表達,凝集素可作為腫瘤組織源性的標記、腫瘤特異性診斷的標志、腫瘤惡性的標記和不同腫瘤的分化標記。如張華忠等（1987）報道115例胃癌標記PHA陽性率高達90.43%，而正常胃粘膜基本是陰性，故認為PHA是胃癌的診斷性標志。SBA對乳腺惡性腫瘤陽性率達79%，而對良性病變均呈陰性反應，提示SBA可能為乳腺惡性腫瘤的相關標志。凝集素還有助于判別腫瘤的組織類型，如神經系統(tǒng)星形細胞瘤ConA陽性，小膠質細胞瘤陰性。

32、 在腫瘤中，凝集素的不同分布導致凝激素受體分布改變。,4.細胞骨架異常與腫瘤,細胞骨架由微管(microtuble)、微絲(microfilament)和中間纖維(intermediate filgament)組成。在長期傳代的腫瘤細胞中微管顯著減少，細胞表面的微突也減少。腫瘤細胞微管的變化主要發(fā)生在間期,而在分裂期,紡錘體微管與正常細胞相同。 研究表明,微絲束和其末端粘著斑的破壞以及肌動蛋白小體的出現(xiàn),可能與腫瘤的浸潤轉移

33、特性有關,肌動蛋白小體形成,可能代表腫瘤細胞高轉移的惡性表型。,腫瘤細胞（紅色染色顯示細胞骨架，藍色的是細胞核）,正常細胞,5.不同類型癌細胞的形態(tài)特征,癌細胞大致可分為三大類： 鱗癌、腺癌、未分化癌,1．鱗癌,一般起源于鱗狀上皮，也可起源于已經發(fā)生鱗化的柱狀上皮。根據(jù)涂片中大多數(shù)癌細胞的分化程度，可把鱗癌分為高分化和低分化兩大類。,以類似表層細胞的癌細胞為主，并可見少量中層癌細胞，這些癌細胞分化比較成熟，表現(xiàn)

34、多形性，如纖維形、蝌蚪形、蛇形等癌細胞，常散在分布。癌細胞胞質角化明顯，故稱角化型鱗癌。,高分化(角化型)鱗癌,癌細胞形態(tài)類似底層鱗狀上皮細胞，少數(shù)類似中層鱗狀上皮細胞，不出現(xiàn)或很少出現(xiàn)表層癌細胞。癌細胞形態(tài)主要為圓形、卵圓形，多數(shù)成片脫落，也可單個散在，胞質少、不角化。HE染色呈暗紅色，巴氏染色為暗綠色，核大，核仁清楚。,低分化(非角化型)鱗癌,巴氏染色,一般起源于柱狀上皮和腺上皮。根據(jù)癌細胞大小，細胞內的粘液多少，有無形成腺腔樣結構

35、，腺癌亦可分為高分化和低分化兩型。,2．腺癌,常形成腺樣排列。癌細胞大，胞質豐富，HE染色為淺紅色，巴氏染色為淺綠色，其中可見粘液空泡。核大，核染色質顆粒粗，染色深，核仁巨大。,高分化腺癌,癌細胞小、胞質少，嗜堿性，粘液空泡少見。癌細胞常成團脫落，排列緊密，形成桑椹樣結構。核小偏位，邊緣胞質隆起。核染色質較粗，核仁小。,低分化腺癌,,,低分化前列腺癌,一般認為起源于支氣管上皮的嗜銀細胞，可產生多肽類激素而引起內分泌癥狀，故屬于神經內分泌

36、腫瘤。癌細胞小，圓形、卵圓形或瓜子形。胞質極少，細胞核約比淋巴細胞大半倍到一倍，核畸形明顯，染色深，癌細胞排列緊密而不重疊，成片出現(xiàn)時，往往呈鑲嵌樣結構；單行排列時呈束狀。這是未分化癌的特征性表現(xiàn)。,3．小細胞型未分化癌,小細胞未分化癌(HE染色）,小細胞未分化癌(巴氏染色）,鱗癌細胞、腺癌細胞和未分化癌細胞的鑒別,小結,腫瘤細胞的形態(tài)特征,核質比顯著高于正常細胞；出現(xiàn)巨核、雙核或多核，染色體呈不均一狀態(tài)；線粒體表現(xiàn)為不同的多型性、