細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn),海洋科學(xué)系劉均玲（13698999696）,實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞膜的滲透性,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1. 掌握細(xì)胞膜通透性的實(shí)驗(yàn)方法。2. 觀察并掌握相對(duì)分子量、脂溶性大小、電解質(zhì)和非電解質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。,細(xì)胞膜在不斷變化的環(huán)境中必須保持自身的穩(wěn)定狀態(tài)才能生存。細(xì)胞膜允許一些物質(zhì)通透，又能降低甚至阻止另一些物質(zhì)的通透，所以細(xì)胞膜具有選擇通透性。,二、實(shí)驗(yàn)原理,未溶血,溶血,血紅蛋白從紅細(xì)胞中逸出的現(xiàn)象稱為溶血現(xiàn)象。滲

2、入紅細(xì)胞的溶質(zhì)能提高紅細(xì)胞滲透壓，使水進(jìn)入紅細(xì)胞，引起溶血及細(xì)胞膜破裂。此時(shí)光線較容易通過(guò)溶液，使溶液呈現(xiàn)透明即溶血。,二、實(shí)驗(yàn)原理,二、實(shí)驗(yàn)原理,在不同相對(duì)分子量、脂溶性大小以及電解質(zhì)和非電解質(zhì)等各種溶液中， 紅細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)各種溶質(zhì)的滲透性不同。由于溶質(zhì)透入速度不同，溶血時(shí)間也不同。因此，通過(guò)觀察紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象時(shí)間的不同來(lái)記錄滲入速度，從而測(cè)量各種物質(zhì)通透性的差別。,三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和主要試劑,1. 實(shí)驗(yàn)材料：雞血。2. 實(shí)驗(yàn)器材：

3、 小燒杯，試管，試管架，刻度吸管，注射器，秒表等。3. 試劑 0.9%生理鹽水； 2種低滲溶液：0.017mol/L氯化鈉和0.032mol/L葡萄糖； 10種等滲溶液：0.17mol/L氯化鈉、0.32mol/L葡萄糖、0.17mol/L氯化銨、0.17mol/L醋酸銨、0.17mol/L硝酸鈉、0.12mol/L草酸銨、0.12mol/L硫酸鈉、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、

4、0.32mol/L丙酮。,50%兔紅細(xì)胞懸液的制備（制備流程如下） ： 以無(wú)菌方法抽取雞靜脈血液（1 mL兔血加0.9%生理鹽水9 mL）混勻，離心（3000rpm）5min 棄上清 取沉淀 加0.9%生理鹽水， 離心

5、（3000rpm）5min，重復(fù)3次 棄上清 取沉淀，用生理鹽水稀釋， 制成50%雞紅細(xì)胞懸液備用,,,,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,,,,,,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,溶血現(xiàn)象的觀察： 取試管2支，分別加入0.017mol/L氯化鈉和0.032mol/L葡萄糖低滲溶液3ml ，再加入2滴制備好的50%雞紅細(xì)胞懸液，注意觀察溶液顏色的變化，由不透明

6、的紅色懸液變成透明的血紅蛋白溶液（紅細(xì)胞發(fā)生破裂，造成100%紅細(xì)胞溶血，使光線比較容易透過(guò)溶液）。,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,紅細(xì)胞的滲透性（1）取試管一支，加入0·17mol/L氯化鈉溶液3ml，再加入2滴制備好的50%雞紅細(xì)胞懸液，輕輕搖動(dòng)，混勻后靜置于溫室中，觀察試管中發(fā)生溶血的時(shí)間及其變化。注意是否有顏色變化？是否有溶血現(xiàn)象？為什么？,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,（2）分別在下列幾種等滲溶液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，步驟同（1）。

7、 0.32mol/L葡萄糖 0.17mol/L氯化銨 0.17mol/L醋酸銨 0.17mol/L硝酸鈉 0.12mol/L草酸銨 0.12mol/L硫酸鈉 0.32

8、mol/L甘油 0.32mol/L乙醇 0.32mol/L丙酮,五、注意事項(xiàng),試管中有紅細(xì)胞和測(cè)試溶液時(shí)，不應(yīng)強(qiáng)力搖晃，以免造成人為的紅細(xì)胞破裂。目測(cè)法判斷標(biāo)準(zhǔn)：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－。 溶血現(xiàn)象可用一張有字的白紙來(lái)輔助識(shí)別，能夠清楚地透過(guò)溶液看到溶液后方紙上清晰的字跡時(shí)，為完全溶血。因相對(duì)分子質(zhì)量大小對(duì)膜通透性有影響，所以將溶

9、血時(shí)間適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)至15min，15min時(shí) 仍然不溶即判斷為不溶血。,,六、作業(yè),記錄觀察到的現(xiàn)象，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和比較。,實(shí)驗(yàn)二 雞血細(xì)胞的體外融合試驗(yàn),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求,掌握PEG體外誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理和基本方法。掌握在光學(xué)顯微鏡下融合細(xì)胞的形態(tài)特征。,細(xì)胞融合是用人工的方法使兩個(gè)或以上的細(xì)胞融合成異核細(xì)胞。異核細(xì)胞可進(jìn)入有絲分裂，使來(lái)自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因組合在一起，形成只含一個(gè)細(xì)胞核的雜種細(xì)胞。,二、實(shí)驗(yàn)原理,PEG溶

10、液作為助融劑可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處脂類分子發(fā)生疏散和重組，引起細(xì)胞融合。,二、實(shí)驗(yàn)原理,細(xì)胞融合的頻率和活力與所用 PEG的分子質(zhì)量、濃度、作用時(shí)間以及細(xì)胞的生理狀態(tài)及密度等有關(guān)。本方法用分子質(zhì)量為400～ 6000的PEG溶液可引起細(xì)胞的聚集和粘連，產(chǎn)生高頻率的細(xì)胞融合。,二、實(shí)驗(yàn)原理,三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑,1. 材料：成年家雞。2. 主要儀器： 注射器、刻度離心管、離心機(jī)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、水浴鍋、滴

11、管、顯微鏡、燒杯、容量瓶、凹面載玻片、蓋玻片、酒精燈等。3. 主要試劑： 0.85% NaCl溶液、GKN液、50%（W/V）PEG400溶液、Hanks液、0.5%酚紅、Janus green 染液等。,1. 雞血細(xì)胞懸液的制備 從家雞的翼根靜脈采血制備抗凝全血。 加入4倍體積的0.85 %NaCl溶液，制成紅細(xì)胞儲(chǔ)備液，保存于4℃。取雞血細(xì)胞儲(chǔ)備液1ml，加入4ml 0.85 %NaCl溶液，混勻后，1200

12、rpm離心5min，棄去上清液，再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述條件離心一次。最后，棄去上清液，加入10ml的GKN溶液制成雞血細(xì)胞懸液。取0.5ml雞血細(xì)胞懸液，用GKN溶液稀釋至1X107個(gè)/ml，備用。,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,2. 雞血細(xì)胞的收集 吸取1ml雞血細(xì)胞懸液放入離心管中，加入4mlHanks液混勻，1000rpm離心5min。棄去上清液，用手指輕彈離心管底部，使沉淀的血細(xì)胞團(tuán)塊松散。3. PEG誘

13、導(dǎo)細(xì)胞融合 吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿著離心管壁逐滴加入，邊加邊輕搖離心管，使PEG與細(xì)胞混勻，然后在37℃水浴中靜置2min。,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,4. 終止PEG作用 緩慢加入5ml Hanks液，輕輕吹打混勻，于37℃水浴中靜置5min。5. 細(xì)胞懸液的制備 用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)數(shù)次使細(xì)胞團(tuán)分散，1000rpm離心5min，使細(xì)胞完全沉降。棄去上清液，加Hanks液，再離心一

14、次，棄多數(shù)上清，留少許溶液，混勻。,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,6. 計(jì)算細(xì)胞融合率 細(xì)胞融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞其細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)之百分比。 融合率 = 視野內(nèi)融合細(xì)胞的核數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞的總核數(shù)×100％,,7. 染色和鏡檢 吸取細(xì)胞懸液，在凹面載玻片上滴一滴，加入Janus green染液混勻，染色3min后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融

15、合情況（注意區(qū)分細(xì)胞融合與細(xì)胞重疊）。,四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟,五、注意事項(xiàng),1. 高Ca2+濃度能夠提高細(xì)胞融合率。有些抗凝劑中含有和Ca2+結(jié)合的化合物，與血液中的Ca2+形成難解離的可溶性絡(luò)合物，導(dǎo)致血液中的Ca2+ 濃度降低，故起抗凝血作用，但同時(shí)會(huì)造成細(xì)胞的融合率較低。2. 必須嚴(yán)格控制PEG的作用時(shí)間，通常處理細(xì)胞1～2min。PEG和二甲基亞砜（DMSO）并用，可以提高細(xì)胞的融合率。 3. 融合細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)就變成一個(gè)雜種細(xì)

16、胞，它的染色體數(shù)不是兩核的倍數(shù)，因?yàn)橐恍┤旧w會(huì)逐漸消失。,六、作業(yè),繪細(xì)胞融合過(guò)程圖。,實(shí)驗(yàn)三 石蠟切片法,一 、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉石蠟切片的制作過(guò)程。掌握HE染色的基本原理和染色方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理,石蠟切片是最基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。蘇木素與伊紅對(duì)比染色法（簡(jiǎn)稱H.E.對(duì)染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對(duì)組織細(xì)胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構(gòu)造，而且適

17、用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長(zhǎng)期保存。經(jīng)過(guò)HE染色，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。,三 、實(shí)驗(yàn)用品,1. 器材 切片機(jī)、水浴鍋、染色缸、玻片、顯微鏡、試劑瓶、剪刀、鑷子、烘箱、離心管或青霉素瓶子。2. 試劑 蘇木色精、伊紅、二甲苯、中性樹膠、酒精、石蠟、氨水、鹽酸、蛋清、甘油。3. 試驗(yàn)材料 羅非魚肝臟組織,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1、取材2、固定3、漂洗4、脫水5、透明6

18、、透蠟7、包埋8、修塊9、切片10、染色,1. 取材到切片,取材——固定（Cannoy’s），材料厚度2mm。100%酒精——100%酒精——二甲苯:酒精（1:1）——二甲苯——二甲苯——二甲苯:石蠟（65℃ 1:1）——石蠟（65℃）——石蠟（65℃），以上處理各20min，最后一步石蠟也20min 。包埋——修塊——切片——貼片,2. 脫蠟與復(fù)水,二甲苯——二甲苯——二甲苯/無(wú)水乙醇(1/1)——無(wú)水乙醇 ——無(wú)水乙醇—

19、—95%乙醇——80%乙醇——70%乙醇——50%乙醇——蒸餾水。以上處理各2-3min。,3. 染色與觀察,1%蘇木色精（5min）——水洗——0.5%鹽酸分色（數(shù)秒）——水洗——0.4%氨水藍(lán)化——水洗（ 5min ）——70%酒精——80%酒精——1%伊紅（95%酒精溶解）——95%酒精——95%酒精——100%酒精——100%酒精——酒精/二甲苯——二甲苯——二甲苯——中性樹膠封片。未注明時(shí)間的一律處理2-3min。,五、作

20、業(yè),簡(jiǎn)述石蠟切片過(guò)程，繪制你所觀察到的細(xì)胞形態(tài)。提交一張你制作較好的玻片。,實(shí)驗(yàn)四 植物細(xì)胞骨架的觀察,,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握考馬斯亮藍(lán)R250 對(duì)植物細(xì)胞骨架染色的方法。 通過(guò)對(duì)洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞的處理，掌握植物細(xì)胞骨架的制備方法與顯微形態(tài)觀察。,二、實(shí)驗(yàn)原理,細(xì)胞骨架(cytoskeleton)，是細(xì)胞內(nèi)以蛋白質(zhì)纖維為主要成分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)蛋白質(zhì)纖維的直徑、組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞的

21、形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分裂等有重要的作用。本試驗(yàn)采用去垢劑TritonX-100 的緩沖液處理植物材料時(shí)，可將細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和大部分蛋白質(zhì)抽提掉，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白卻被保存下來(lái)，后者用考馬斯亮藍(lán)R250 染色，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。,三、實(shí)驗(yàn)用品,1. 試驗(yàn)材料 ： 洋蔥2. 器材： 顯微鏡、載玻片、滴管、擦鏡紙、 PH 計(jì)3. 試劑： 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖生理鹽水(

22、PBS) 0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4緩沖液（PB，PH7.3） 50ml、0.15mol/L NaCl、加雙蒸餾水加至1000mlPB 0.2mol/L Na2HPO4 77ml 0.2mol/L NaH2PO4

23、23ml,M-緩沖液 咪唑(PH 6.7) 50mmol/L KCl 50mmol/L MgC12 0.5mmol/L EGTA

24、 1mmol/L EDTA 0.1mmol/L 巰基乙醇 1mmol/L 甘油 4mmol/L 用1mol/L HCl 調(diào)pH 至7.

25、2。,,1%的Triton X-100/M-緩沖液0.2%考馬斯亮藍(lán)R250 染液 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸餾水 46.5ml3%戊二醛-

26、 PB 溶液（pH7.3）,四、實(shí)驗(yàn)步驟,取洋蔥內(nèi)皮1cm 左右 置于含PBS 液的載玻片上 濕潤(rùn)后，吸去PBS 加2 滴1%Triton X-100/M-緩沖液，5min 吸去緩沖液，加3%戊二醛-PB 溶液，固定30min 加PBS 洗2 次，共3min 加0.2%考馬斯亮藍(lán)R250 染色30min 用P