t載使用中常見問題

1、T栽使用說明Q1：TA克隆的原理大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都會(huì)在PCR產(chǎn)物的3′末端添加一個(gè)“A”，T載體是3′帶有一個(gè)“T”的載體，在連接酶作用下，完成連接，其連接液可以直接用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。TA克隆的原理請(qǐng)見下圖：Q2：藍(lán)白斑篩選的原理藍(lán)白斑篩選原理是：載體上攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼β半乳糖苷酶的一段146個(gè)氨基酸的α肽，載體轉(zhuǎn)化的受體菌為lacZ△M15基因型。這樣，載體同宿主通過互補(bǔ)，具有

2、完整的β半乳糖苷酶的活性。如果在載體的lacZ基因中插入外源DNA，造成lacZ基因缺失，不能合成α肽，失去同宿主的互補(bǔ)，不能形成有功能的β半乳糖苷酶，失去分解Xgal的能力。在Xgal平板上，含陽性重組體的細(xì)菌為白色菌落（質(zhì)粒載體）或無色噬菌斑（M13噬菌體載體）；非重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為藍(lán)色菌落或藍(lán)色噬菌斑。Q3：Takara有哪些常用的PCR產(chǎn)物克隆用T載體，各有什么特點(diǎn)常用的PCR產(chǎn)物克隆用T載體及各自的特點(diǎn)請(qǐng)見下表：CodeNo.

3、產(chǎn)品特點(diǎn)應(yīng)用3275pBackZeroTVectCloningKit由pUC19改建，陽性克隆率極高而背景極低。它消除了pUC19載體上的lacZ基因及多克隆位點(diǎn)，并對(duì)βlactamase(bla)基因進(jìn)行了獨(dú)特的改造，可以定向克隆。使用時(shí)需在待插入的DNA片段的上、下游Primer的5′端加上TTTAA5個(gè)堿基。如果需要進(jìn)行定向克隆，只需在一條引物的5′端加上TTTAA5個(gè)堿基。PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆。6011pMD?18

4、TVectCloningKit由pUC18構(gòu)建，含有多克隆位點(diǎn)，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆。6013pMD?19TVectCloningKit由pUC19構(gòu)建，含有多克隆位點(diǎn)，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆。3271TVectpMD?19(Simple)由pUC19構(gòu)建，不含有多克隆位點(diǎn)，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆。根據(jù)實(shí)

5、驗(yàn)需要，可以在引物的5＇端導(dǎo)入酶切位點(diǎn)。6012pSIMPLE19EcVBAPVect由pUC19構(gòu)建，不含有多克隆位點(diǎn)，是種平末端去磷酸化載體，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。與5′端磷酸化的平末端PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接。3270TVectpMD?20由pUC19構(gòu)建，含有多克隆位點(diǎn)；并對(duì)lacZ基因進(jìn)行改造，降低假陽性，可以進(jìn)行藍(lán)白篩選，無方向性克隆。PCR產(chǎn)物3′端有“A”，TA克隆；含有SP6Promoter，可以對(duì)插入的DNA進(jìn)行

6、體外轉(zhuǎn)錄。Q4：pMD19TVect與pMD18TVect相比，有何不同pMD19TVect與pMD18TVect相比，β半乳糖苷酶的表達(dá)活性更高，菌落顯示藍(lán)色的時(shí)T栽使用說明通常使用載體的通用引物進(jìn)行測(cè)序。1pMD18TVect來源于pUC18載體，M1347和RVM等pUC18載體測(cè)序的通用引物都可以使用。2pMD19TVect、TVectpMD?19(Simple)和pSIMPLE19EcVBAPVect來源于pUC19載體，M1

7、347和RVM等pUC19載體測(cè)序的通用引物都可以使用。3TVectpMD?20來源于pUC19載體，M1347和RVM等pUC19載體測(cè)序的通用引物都可以使用。Q11：使用Takara的T載體，需要注意哪些問題1SolutionI請(qǐng)于冰中融解。2克隆時(shí)使用的DNA片段（PCR產(chǎn)物）建議進(jìn)行切膠回收純化，否則PCR產(chǎn)物中的短片段DNA（甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段）、殘存引物等雜質(zhì)都會(huì)影響TA克隆效率。3按照本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行連接后

8、，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的連接液不要超過20μl。當(dāng)要轉(zhuǎn)化的DNA量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時(shí)，需對(duì)連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。進(jìn)行乙醇沉淀時(shí)使用Dr.GenTLEPrecipitationCarrier（CodeNo.9094）可以提高DNA的回收率。4連接反應(yīng)請(qǐng)?jiān)?5℃以下進(jìn)行，溫度升高（26℃）較難形成環(huán)狀DNA。連接效率偏低時(shí)，可適當(dāng)延長連接反應(yīng)時(shí)間至數(shù)小時(shí)。5Takara克隆用T載體來源于pUC18或pUC19載體。因此，

9、適合pUC18和pUC19載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用，如：JM109等。Q12：使用Takara的T載體，陽性克隆鑒定方法有哪些陽性克隆的鑒定方法有多種，主要的方法有以下幾種：1藍(lán)白斑篩選。藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，一般情況下，β半乳糖苷酶的表達(dá)將受到破壞，重組克隆體在含有XGal、IPTG、Amp的L瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)將顯示白色菌落。但有時(shí)比較短的DNA片段插入載體時(shí)，基因的讀碼框有可能正好與lacZ的讀碼框相吻合，克隆體

10、也會(huì)顯示藍(lán)色菌落。有報(bào)道稱，2kb的DNA片段插入到載體中后，重組克隆體仍顯示了藍(lán)色。所以，當(dāng)我們沒有得到白色菌落時(shí)，可以試著檢測(cè)藍(lán)色菌落。2菌落PCR方法。以變性后的菌液為模板，使用載體通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。使用滅菌后的牙簽挑取白色菌落，在預(yù)備好的dH2O（10μl）中蘸洗，99℃，10min變性，冰上急冷，加入配制好的PCR混合液（引物，dNTP，Buffer，TaKaRaTaq等）。94℃1min94℃30sec55℃30s