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1、植物組織石蠟切片的制作以及注意事項(xiàng)植物組織石蠟切片的制作以及注意事項(xiàng)1植物組織石蠟切片的制作方法植物組織石蠟切片的制作方法⑴固定:用50%或70%FAA固定液(50%或70%酒精:甲醛:冰乙酸=16:1:1幼嫩材料用50%FAA;老的材料用70%的FAA),置于4℃固定24h。⑵脫水:將固定液倒去,加入50%乙醇,室溫靜置30min;重復(fù)一次,室溫靜置20min。換成1%番紅O溶液(用70%酒精配制),室溫脫水染色過(guò)夜。次日繼續(xù)脫水,酒
2、精濃度梯度和時(shí)間依次為:80%乙醇1h、95%乙醇1h、無(wú)水乙醇1h、40min(2次)。⑶透明:12無(wú)水乙醇二甲苯混合液1h,純二甲苯1h、40min(2次)。最后加入少量二甲苯(浸沒(méi)材料即可)和碎蠟,放入38℃溫箱中過(guò)夜。⑷浸蠟:將溫箱溫度調(diào)至56℃,計(jì)時(shí)1h;換成二級(jí)蠟1h;三級(jí)蠟(3次)各1h、1h、40min(從溫度上升到56℃開(kāi)始計(jì)時(shí))。⑸包埋:將帶有材料的液體蠟倒入疊好的紙槽中,迅速放入冰水中使蠟?zāi)蹋乐箽馀莓a(chǎn)生,以及凝
3、蠟不勻。⑹切片:修整蠟塊,用LicaRM2126切片機(jī)切片,厚度510μm。⑺貼片:在載玻片上涂少許粘片劑,將切好的蠟帶放入溫水中,撈至載玻片上,最后置于37℃恒溫箱過(guò)夜烤片。⑻脫蠟及染色:①番紅固綠對(duì)染ⅰ脫蠟:二甲苯60min,二甲苯5min、12無(wú)水乙醇12二甲苯混合液5min、無(wú)水乙醇5min、無(wú)水乙醇5min、95%乙醇5min、80%乙醇5min、1%番紅室溫過(guò)夜。ⅱ染色:80%乙醇5min,1%固綠(用95%酒精配制)迅速蘸
4、一下,大約10s,直接放到95%乙醇5min、無(wú)水乙醇5min、無(wú)水乙醇5min、12無(wú)水乙醇12二甲苯混合液5min、二甲苯5min(2次)。假如擔(dān)心,最好底下放一個(gè)培養(yǎng)皿接著,如有倒出,則流在皿里面,容易觀察到,可以重新放在瓶中。如果不能順利的將瓶子里的脫水酒精倒干凈,則建議找一個(gè)橡膠洗頭,套上1ml槍頭,將里面的液體全部吸出。這樣也避免用槍吸,有機(jī)溶劑腐蝕槍而使得槍受到破壞。當(dāng)重新?lián)Q完下一梯度的脫水酒精時(shí),一定要檢查是否有組織粘在
5、瓶壁上,而沒(méi)有浸泡在脫水液體里,使得脫水不干凈。當(dāng)脫水至純酒精和二甲苯時(shí),一定不能讓組織在就酒精中停留的時(shí)間太長(zhǎng),時(shí)間一長(zhǎng)容易使得組織變硬變脆,此時(shí)以及以后的操作的步驟中,動(dòng)作一定要輕緩,任何操作儀器一定不能碰到組織。第2次二甲苯透明結(jié)束時(shí),倒掉瓶中的大部分二甲苯,留底部的液體在。然后給瓶子倒入事先準(zhǔn)備好的碎末固體蠟,在試驗(yàn)臺(tái)蹦實(shí),使得組織完全包埋在碎蠟里。放在37度恒溫箱過(guò)夜。這樣做的目的是因?yàn)橹参锝M織有細(xì)胞壁,石蠟不容易浸入組織,因
6、此需要足夠長(zhǎng)時(shí)間的浸蠟。(3)浸蠟次日將恒溫箱調(diào)至56度后開(kāi)始計(jì)時(shí),浸蠟。1h后倒掉瓶里的石蠟,換上新鮮的純石蠟,必須要過(guò)濾,并且溫度不能太高或者太低。換下的蠟里由于含有事先殘留瓶中的二甲苯,必須將其中的二甲苯揮發(fā)掉,才能使用,因?yàn)槭灷锛偃绾卸妆降脑?,?huì)使得石蠟?zāi)毯笞冘?。一旦包埋了組織,切片是由于蠟軟不易切片。消除石蠟里二甲苯的方法時(shí),將蠟在電爐上煮,二甲苯將變成氣泡,而揮發(fā)掉,直到液體石蠟不再產(chǎn)生氣泡。還有一點(diǎn)值得提出的是,新
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