冷凍切片方法及注意事項(xiàng)

1、一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)及儀器。開啟冷凍切片機(jī)并將冷凍切片機(jī)預(yù)降至所需溫度（15~20℃）。準(zhǔn)備好處理好的載玻片、刀片、膠水以及藥品。二、取材解剖之后迅速取出所需的新鮮組織，用干紗布或?yàn)V紙擦干后不需固定直接取材（24242mm）以防形成冰晶造成切片中形成形狀不一的空泡使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)移位。（注：取材中目的標(biāo)本既要明確也要確保其結(jié)構(gòu)的完整性，應(yīng)避免不必要的脂肪及壞死組織附著要盡量剔除毛發(fā)、硬骨或鈣化物保乳手術(shù)切緣由于脂肪組織較多取材厚度最好不

2、要超過3mm，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整。甲狀腺及淋巴結(jié)組織要帶全組織被膜并除去多余的脂肪組織。）三、冷凍切片1、取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上冰凍，用吸熱器壓住組織，至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片（1~3分種）。2、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。3、調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10μm

3、間。4、調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｇ衅瑫r(shí)，以切出完整、平滑的切片為準(zhǔn)。切好的組織在干凈的玻片上黏附時(shí)順著一個(gè)方向稍微用力輕輕一帶可避免組織攤片過程中皺折保證組織結(jié)構(gòu)的完整及切片的美觀。注：①包埋劑的選用：包埋劑是對(duì)冷凍切片質(zhì)量一重要影響因素，包埋劑用量要適宜，過多或過少都會(huì)影響標(biāo)本冷凍質(zhì)量。常用的有三種包埋劑OCT劑、B超藕合劑以及普通膠水。B超藕合劑適用

4、于細(xì)胞豐富質(zhì)地較嫩的組織普通膠水或OCT劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬組織。（OCT包埋劑驟冷時(shí)固化，其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近，其還具有水溶性，不影響染色等優(yōu)點(diǎn)。）②組織塊過?。合葘⑸倭磕z擠在托架上預(yù)先放在冰凍機(jī)中冷凍約30秒鐘左右待膠凝固時(shí)將小組織放上組織周圍再加一些膠再次置于冷凍機(jī)中冷凍這樣組織被墊高就能快速切出高質(zhì)量的切片。③冷凍箱及冷凍頭的溫度高低，要根據(jù)不同的組織而定。溫度過低會(huì)導(dǎo)致組織塊過硬切片碎裂出現(xiàn)梯田狀薄厚不均或空洞反

5、之溫度過高組織塊硬度不夠切片不易成形或成皺褶。數(shù)據(jù)圖1供參考。④當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點(diǎn)。⑤用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出④分化(1%酸乙醇分化)。⑤于堿水(氨水)中返藍(lán)20秒。⑥伊紅染色10－20秒。⑦脫水，透明，中性樹膠封固。注：固定

6、液的選擇A中性福爾馬林溶液B95%乙醇CAF(40%福爾馬林10ml95%乙醇90ml)DCarnoy(純乙醇60ml氯仿30ml冰醋酸10ml)EClzrke改良液[4](純乙醇95ml冰醋酸5ml)FBouin液(飽和苦味酸水溶液75ml甲醛水溶液25ml冰醋酸5ml)6種固定液固定后的組織切片染色效果各有差異其中C固定液固定的切片染色效果最好組織結(jié)構(gòu)清晰核染色鮮艷核無明顯腫脹核漿對(duì)比度好鏡下與石蠟切片相似(圖1)。D液、E液、F液

7、染色效果均較好結(jié)構(gòu)較清晰核染色較鮮艷但核有腫脹核輪廓有些模糊。A液染色效果較差組織結(jié)構(gòu)尚清楚但細(xì)胞核腫脹比較明顯且境界模糊不清(圖2)。B液染色效果差核著色不良結(jié)構(gòu)模糊。甲醛、乙醇、冰醋酸、苦味酸對(duì)組織均有固定作用。甲醛對(duì)組織的穿透力強(qiáng)對(duì)組織無明顯收縮和膨脹作用但它不能抵消因冷凍所引起的細(xì)胞內(nèi)液體的膨脹所以甲醛固定的組織結(jié)構(gòu)尚完好核有腫脹、模糊。乙醇對(duì)組織有脫水收縮作用并可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白但后者所產(chǎn)生沉淀可溶解于水使核著色不良

8、。冰醋酸對(duì)組織有明顯的膨脹作用加重了冷凍所引起的細(xì)胞內(nèi)液體的膨脹所以用含有冰醋酸的混合固定液(如D液、E液、F液)固定的組織核腫脹明顯。F液中雖然苦味酸對(duì)組織有明顯的收縮作用但有冰醋酸的存在仍然防止不了細(xì)胞的腫脹。本實(shí)驗(yàn)提示混合固定液對(duì)冷凍切片HE染色的效果優(yōu)于單純固定液但最好使用不含有冰醋酸的混合液。因此推薦冷凍切片做HE染色時(shí)首選AF固定液。同時(shí)其具有配制簡(jiǎn)單、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。六、實(shí)驗(yàn)后打掃冷凍切片機(jī)使用結(jié)束后關(guān)閉電源清潔腔體和擦干