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1、熒光標(biāo)記法是一種價(jià)格低廉,方法簡(jiǎn)便,環(huán)境友好,靈敏度高的非放射性標(biāo)記手段。本文通過(guò)熒光標(biāo)記法研究魚(yú)類(lèi)γ-氨基丁酸(GABA)受體與苯二氮類(lèi)及殺蟲(chóng)劑類(lèi)藥物的相互作用,進(jìn)一步比較魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物腦內(nèi)GA BA受體的異同,對(duì)研制高選擇性、環(huán)境友好的綠色農(nóng)藥具有重要意義。本文研究結(jié)果如下:
第一,采用1% Nonidet P-40,1% Triton X-100,4% CHAPS,0.5% Lubrol-PX,2% OCTG,2%脫氧膽
2、酸鈉等六種去垢劑增溶GABA受體蛋白,比較了其溶出效率;結(jié)果表明1% Nonidet P-40溶出量最多,達(dá)到729μg/mL。
第二,通過(guò)比較Ro7-1986/1和氟蟲(chóng)腈兩種親和柱對(duì)鳙魚(yú)腦GABA受體分離純效率,發(fā)現(xiàn)Ro7-1986/1親和柱對(duì)鳙魚(yú)GABA受體的分離效率高于氟蟲(chóng)腈親和柱,分離效率為32.0%。
第三,成功制備兩種GABA受體的配體熒光復(fù)合物:FITC-Ro7和FITC-氟蟲(chóng)腈,利用傅里葉紅外光譜(F
3、TIR)和氫譜核磁共振(1H-NMR)等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。
第四,熒光標(biāo)記法實(shí)驗(yàn)測(cè)得Ro7-1986/1和氟蟲(chóng)腈與魚(yú)類(lèi)GABA受體的親和常數(shù)Kd值分別為67±5nmol/L和346±6nmol/L;最大結(jié)合量[RT]值分別為13.8±1.8pmol/mg protein和40.6±3.5pmol/mg protein。結(jié)果表明:同哺乳動(dòng)物相比,Ro7-1986/1對(duì)鳙魚(yú)腦GABA受體結(jié)構(gòu)親和力與哺乳動(dòng)物相似。而氟蟲(chóng)腈對(duì)魚(yú)類(lèi)
4、和昆蟲(chóng)GABA受體親和力明顯比哺乳動(dòng)物高,這可能是氟蟲(chóng)腈對(duì)魚(yú)類(lèi)毒性高于哺乳動(dòng)物毒性的一方面原因。
第五,通過(guò)測(cè)定游離配體、含受體蛋白結(jié)合配體以及甲醇解離所得結(jié)合配體這三種方法比較,發(fā)現(xiàn)通過(guò)測(cè)定甲醇解離得到的Kd值最小,F(xiàn)ITC-Ro7和FITC-氟蟲(chóng)腈的Kd值分別為67±5nmol/L和346±6nmol/L,更接近真實(shí)值。
第六,競(jìng)爭(zhēng)性取代試驗(yàn)結(jié)果表明,F(xiàn)ITC-Ro7特異性結(jié)合隨GABA濃度的升高而逐漸增加,說(shuō)明
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