病毒制造

1、病毒制造Virus Manufacturing從負(fù)到正的大變革Huge Transformation from Negative to Positive,主講：張婷,思考：,什么是病毒（生物學(xué)概念）？病毒為何會得到化學(xué)化工專家的重視？M13噬菌體病毒的結(jié)構(gòu)是如何的？要獲得所需的噬菌體，需要經(jīng)過哪些步驟進(jìn)行改造？M13噬菌體病毒有何應(yīng)用？,1. 病毒制造——從大千世界說起,大千世界——“活”的世界：動物、植物、微生物。,1.

2、 病毒制造——從大千世界說起,什么是病毒？（生物學(xué)概念）病毒（Virus）由一種核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)（Protein）構(gòu)成或僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成。病毒個體微小，結(jié)構(gòu)簡單；沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，沒有實(shí)現(xiàn)新陳代謝所必需的基本系統(tǒng)，病毒自身不能復(fù)制。但是當(dāng)它接觸到宿主細(xì)胞時，便脫去蛋白質(zhì)外套，它的核酸（基因）侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，借助后者的復(fù)制系統(tǒng)，按照病毒基因的指令復(fù)制新的病毒。目前，科學(xué)界公認(rèn)的對病毒的定義是只能在活著的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的感染

3、源。,①形體極其微小，多數(shù)病毒直徑在100nm(20~200nm），較大的病毒直徑為300－450納米（nm），較小的病毒直徑僅為18-22納米。②沒有細(xì)胞構(gòu)造，其主要成分僅為核酸和蛋白質(zhì)兩種，故又稱“分子生物”；③每一種病毒只含一種核酸，不是DNA就是RNA。④既無產(chǎn)能酶系，也無蛋白質(zhì)和核酸合成酶系，只能利用宿主活細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)成代謝系統(tǒng)合成自身的核酸和蛋白質(zhì)成分。⑤以核酸和蛋白質(zhì)等“元件”的裝配實(shí)現(xiàn)其大量繁殖。⑥在離體條件下，能

4、以無生命的生物大分子狀態(tài)存在，并長期保持其侵染活力。⑦對一般抗生素不敏感，但對干擾素敏感。⑧有些病毒的核酸還能整合到宿主的基因組中，并誘發(fā)潛伏性感染。⑨還有些病毒是沒有DNA或RNA的，例如朊病毒，它是亞病毒（類似于病毒），只有蛋白質(zhì)的那一類，它以病毒為寄主。,病毒能增殖、遺傳和演化，因而具有生命最基本的特征。其主要特點(diǎn)：,病毒幾乎能感染所有的細(xì)胞生物并對其產(chǎn)生病害，如感冒、禽流感、非典型肺炎、肝炎、流行性出血熱、艾滋病……,1.

5、 病毒制造——從大千世界說起,埃博拉病毒,“埃博拉”病毒是人類迄今為止所發(fā)現(xiàn)的死亡率最高的一種病毒，死亡率在50％至90％之間。世界衛(wèi)生組織公布的最新數(shù)字說，自1976年發(fā)現(xiàn)這一病毒以來，全世界的感染者已達(dá)1500多例，其中已有1000多人死亡。 “埃博拉”病毒的形狀宛如 “如意”，極活躍，病毒主要通過體液，如汗液、唾液或血液傳染，甚至握一握手就會傳染。潛伏期為2周左右。感染者均是突然出現(xiàn)高燒、頭痛、咽喉疼、虛弱和肌肉疼痛。然后是嘔吐

6、、腹痛、腹瀉。發(fā)病后的兩星期內(nèi)，病毒外溢，導(dǎo)致人體內(nèi)外出血、血液凝固、壞死的血液很快傳及全身的各個器官，病人最終出現(xiàn)口腔、鼻腔和肛門出血等癥狀，患者可在24小時內(nèi)死亡。,SARS病毒,SARS病毒是冠狀病毒的一個變種，是引起非典型肺炎的病原體。變種冠狀病毒與流感病毒具有親緣關(guān)系，但它是非常獨(dú)特的一種冠狀病毒，在2002年冬到2003年春肆虐全球的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS、傳染性非典型肺炎）的元兇就是這種冠狀病毒。2013年，中國科

7、學(xué)院武漢病毒研究所研究員石正麗帶領(lǐng)的國際研究團(tuán)隊(duì)分離到一株與SARS病毒高度同源的SARS樣冠狀病毒，進(jìn)一步證實(shí)中華菊頭蝠是SARS病毒的源頭。,人類免疫缺陷病毒,人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus;abbr:HIV），即艾滋?。ˋIDS，獲得性免疫缺陷綜合征）病毒，是造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒（Lentivir

8、us），屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。HIV通過破壞人體的T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而阻斷細(xì)胞免疫和體液免疫過程，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)癱瘓，從而致使各種疾病在人體內(nèi)蔓延，最終導(dǎo)致艾滋病。由于HIV的變異極其迅速，難以生產(chǎn)特異性疫苗，至今無有效治療方法，對人類健康造成極大威脅。2015年3月4日，多國科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，艾滋病毒已知的4種病株，均來自喀麥隆的黑猩猩及大猩猩，是人類首次完全確定艾滋病毒毒株的所有源頭。,病毒的結(jié)構(gòu),2.病毒的輔助結(jié)構(gòu)有些病毒核衣殼外還有

9、一層脂蛋白雙層膜狀結(jié)構(gòu)，是病毒以出芽方式釋放，穿過宿主細(xì)胞膜或核膜時獲得的，稱之為包膜。在包膜表面有病毒編碼的糖蛋白，鑲嵌成釘狀突起，稱為刺突。有包膜病毒對有機(jī)溶劑敏感。包膜功能：①保護(hù)核衣殼；②促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的吸附；③具有抗原性。,1.病毒的基本結(jié)構(gòu)有核心和衣殼，二者形成核衣殼。核心位于病毒體的中心，為核酸，為病毒的復(fù)制、遺傳和變異提供遺傳信息；衣殼是包圍在核酸外面的蛋白質(zhì)外殼。衣殼的功能：①具有抗原性；②保護(hù)核酸；③介導(dǎo)病

10、毒與宿主細(xì)胞結(jié)合。,病毒出現(xiàn)假說：,1．蛋白質(zhì)、核酸遺失說：大生物（此處大生物意思是具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物，區(qū)別于病毒的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物）由于細(xì)胞脫落和破裂，導(dǎo)致游離的蛋白質(zhì)和DNA、RNA的出現(xiàn)，在某種情況下，這些蛋白質(zhì)由于化學(xué)作用形成了一個內(nèi)部可容納小分子的結(jié)構(gòu)，里面裹著DNA或者RNA，甚至單獨(dú)的蛋白質(zhì)和單獨(dú)的DNA、RNA游離。2．生命起源說：病毒是最原始的生命體，早在沒有細(xì)胞之前就有病毒存在，那時的病毒還只限于蛋白質(zhì)和核酸，沒

11、有表現(xiàn)出病毒的寄生特征，當(dāng)細(xì)胞體生物出現(xiàn)之后，個別這種蛋白質(zhì)和核酸或他們的復(fù)合體表現(xiàn)出寄生性。,病毒在化學(xué)化工中的“魅力”,化學(xué)化工專家利用病毒的超微結(jié)構(gòu)和非凡的自我復(fù)制能力，制造和組裝了使人類從中受益的各種功能結(jié)構(gòu)。利用生物體系實(shí)現(xiàn)化工產(chǎn)品生產(chǎn)的生物化工技術(shù)，是化學(xué)化工的一個重要方向?！盎睢钡纳矬w，擁有最神奇的化學(xué)分子合成、新物質(zhì)創(chuàng)造的能力。病毒通常為納米級別，病毒的衣殼蛋白、內(nèi)表面和中間界面都可以進(jìn)行基因工程改造或者化學(xué)修飾。

12、作為納米級的生物模板，病毒在新型電子材料和電池開發(fā)、化學(xué)工業(yè)催化劑制備、生物傳感器開發(fā)和痕量化學(xué)品檢測、重大疾病治療等領(lǐng)域?qū)l(fā)揮巨大作用。,2.病毒制造的科學(xué)基礎(chǔ),病毒是目前已知的結(jié)構(gòu)最簡單、“活”的生命單位。有些病毒侵染的對象是特定的微生物和植物，對人類安全無害，如絲狀的M13噬菌體、球狀的MS2和T7噬菌體、長桿狀的煙草花葉病毒、多面體形狀的豇豆花葉病毒等。,為什么要采用納米級別的“病毒”顆粒作為模板，制造所需的分子機(jī)器或材料以實(shí)

13、現(xiàn)所期望的功能呢？,納米尺度時，材料的表面結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)會發(fā)生顯著改變，產(chǎn)生表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、量子隧道效應(yīng)及庫倫阻塞效應(yīng)等新性質(zhì)，從而賦予其不同的特性和功能。如：晶粒尺寸在納米量級的金屬催化劑有更高的催化活性、選擇性和穩(wěn)定性。生物擁有最神奇的靶標(biāo)定位和檢測、材料合成、加工和功能實(shí)現(xiàn)的能力。如：抗體蛋白能在成千上萬個配體分子中尋找到自己特異性識別的抗原并與之結(jié)合；DNA分子依靠堿基之間特定的互補(bǔ)配對規(guī)則精確自組裝形成雙螺旋結(jié)構(gòu)；酶

14、分子可以特異并專一性的與特定的底物結(jié)合進(jìn)行高效催化。,抗體-抗原特異性分子識別,DNA自我復(fù)制時的堿基結(jié)合,DNA分子精確自組裝,2.病毒制造的科學(xué)基礎(chǔ),病毒制造的實(shí)質(zhì)，就是一種多學(xué)科交叉的生物納米前沿技術(shù)。生物納米技術(shù)的主要研究內(nèi)容：將納米技術(shù)和生物體系的獨(dú)特優(yōu)勢相結(jié)合，借助迅速興起的生物納米技術(shù)，模仿生物系統(tǒng)的能力來轉(zhuǎn)化和傳輸能量、創(chuàng)造生物質(zhì)、合成專用有機(jī)化學(xué)品、實(shí)現(xiàn)特異性識別和檢測、發(fā)送和傳導(dǎo)信息、儲存信息、進(jìn)行有序和可控運(yùn)動、

15、自組裝和復(fù)制等。簡單地說，只要改造病毒的基因，就能得到需要的特殊病毒結(jié)構(gòu)，從而具有精心設(shè)計(jì)的新功能。,2.病毒制造的科學(xué)基礎(chǔ),M13噬菌體病毒,野生型M13噬菌體長800~900nm，直徑6~10nm。它的單鏈環(huán)狀DNA分子有6407個堿基，編碼噬菌體的11種蛋白，其中，最終成熟的噬菌體顆粒由5種衣殼蛋白（結(jié)構(gòu)蛋白）組成，包括周身包覆的p8衣殼蛋白（pVIII蛋白或g8p）、一個末端的p3衣殼蛋白（pIII蛋白或g3p）和p6（pVI

16、或g6p）以及另一個末端的p7（pVII）和p9（pIX）衣殼蛋白。其他6種由其DNA編碼的蛋白僅出現(xiàn)在DNA復(fù)制和噬菌體裝配的過程中。,在M13噬菌體的5種衣殼蛋白中，末端p3蛋白和周身p8蛋白最早、最廣泛地被用于基因改造和各種新功能的實(shí)現(xiàn)。,成熟的p8蛋白是含有50個氨基酸殘基的螺旋蛋白，大約有2700個拷貝，呈五倍螺旋對稱重復(fù)排列，形成噬菌體的柔性圓柱體衣殼的主要部分，將單鏈環(huán)狀的基因組DNA包裹于其內(nèi)部。P3蛋白是5個拷貝的次

17、要衣殼蛋白，它通過p6蛋白附著在噬菌體顆粒上，是噬菌體吸附宿主細(xì)胞所必需的。,蛋白的結(jié)構(gòu)由它的單鏈DNA基因決定。通過剪切、插入和連接新設(shè)計(jì)的基因序列到p3或p8等基因的上游，擴(kuò)增后的新M13噬菌體就可以在相應(yīng)衣殼蛋白的末端展示出新的精細(xì)結(jié)構(gòu)，并具有相應(yīng)的新功能，如特異性地吸附不同的金屬離子。,M13噬菌體病毒,M13噬菌體病毒,M13噬菌體是一個雄性特異性大腸桿菌噬菌體，當(dāng)基因改造后的M13噬菌體病毒侵染了大腸桿菌細(xì)胞，就會通過細(xì)菌的

18、性菌毛與噬菌體的次要衣殼蛋白p3相互作用，去除主要衣殼蛋白p8，使噬菌體DNA能侵入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。被M13感染的細(xì)胞并不裂解而是繼續(xù)生長，但生長速率僅有正常的1/2至1/3。每個宿主細(xì)菌細(xì)胞每代可產(chǎn)生幾百個病毒顆粒，從細(xì)胞內(nèi)釋放后就可以在培養(yǎng)液中大量積累，產(chǎn)生不計(jì)其數(shù)的具有新外殼結(jié)構(gòu)的M13病毒顆粒。通過基因改造、侵染細(xì)胞、復(fù)制、組裝、釋放和擴(kuò)增等一步步生物過程，可獲得大量的、具有基因改造后的新衣殼蛋白結(jié)構(gòu)的噬菌體并得以應(yīng)用。,,3.

19、病毒制造的大事業(yè),制造病毒電池,鋰離子電池的工作原理,鋰離子電池由正極、負(fù)極和電解液組成。正極材料通常采用磷酸鐵鋰；負(fù)極采用石墨；電解液采用鋰鹽的有機(jī)溶劑溶液，以提供鋰離子。正極材料的鋰離子嵌入位點(diǎn)越多，電池電量越大。,當(dāng)常規(guī)的磷酸鐵鋰作為正極時，提供的鋰離子嵌入位點(diǎn)數(shù)量還不夠多，因此不能滿足手機(jī)電池長時間待機(jī)的需求。,M13噬菌體作為生物模板來制備病毒電池,美國麻省理工學(xué)院的Belcher教授研究組提出！,(a) M13噬菌體分子,(

20、b) 周身p8衣殼蛋白吸附磷酸鐵,噬菌體分子進(jìn)行自組裝，裝配呈病毒電池的正極和負(fù)極石墨，之后，它們與鋰鹽電解液搭建成高效的病毒電池。,(c) 末端p3蛋白識別并“抓住”碳納米管,病毒電池,這種奇妙的病毒電池，具有儲能高、體積小、環(huán)境友好、常溫自組裝等優(yōu)點(diǎn)，功率比鋰電池提升10倍，手機(jī)的待機(jī)時間有望保持?jǐn)?shù)周甚至數(shù)月。,清除重金屬和化學(xué)品污染,六價鈾：具有致命威脅的核污染，能溶解在地下水中，隨地下水到處擴(kuò)散。治理核污染的重要手段：將可溶于

21、水的六價鈾還原成不溶于水的四價鈾。,清華大學(xué)的研究人員首先在溫和條件下快速合成了分散性很好的直徑約為10nm的球型單晶面心立方FCC-Fe納米顆粒，再進(jìn)一步利用M13噬菌體和FCC-Fe形成耦合體系，把攜帶著納米鐵顆粒的M13噬菌體病毒加入到含有六價鈾的污水中，納米鐵快速將六價鈾還原成不溶于水的、2~5nm的UO2納米晶，沉積在M13噬菌體病毒的表面，并可以和病毒顆粒一起，方便回收。,M13噬菌體上的Fe納米顆粒,1個FCC-Fe納米顆

22、粒,采用噬菌體介導(dǎo)的鐵納米顆粒高效還原六價鈾,處理鎘離子,鎘（Cd）離子：鎘可通過食物鏈于生物體內(nèi)富集，從而引起人體的慢性中毒，對腎、脾、胰等內(nèi)臟器官和毛發(fā)、骨骼都能產(chǎn)生不同程度的損害，鎘離子能溶解在水中，隨水到處流動，污染擴(kuò)散。鎘的治理：利用單質(zhì)鐵還原鎘離子生成不溶于水的物質(zhì)。可利用攜帶納米鐵顆粒的M13噬菌體病毒加入到含鎘廢水中發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并使不溶于水的鎘沉積在病毒表面而回收處理。由于還原生成的鎘顆粒易于覆蓋在零價鐵顆粒

23、的表面而導(dǎo)致氧化還原反應(yīng)效率顯著降低。,改進(jìn)方法,二價鎘離子,介導(dǎo)靶向給藥、醫(yī)學(xué)診斷或檢測,噬菌體展示技術(shù)是一種大規(guī)模生物篩選技術(shù)，通過將不同的外源多肽或蛋白與M13噬菌體病毒的p3蛋白末端相融合，可以構(gòu)建得到含有大量待篩選多肽或蛋白分子的M13病毒庫，其數(shù)量在109~1011。,以某個靶標(biāo)蛋白或重要物質(zhì)為目標(biāo)進(jìn)行生物篩選，就可以快速獲得能和靶向目的物質(zhì)特異結(jié)合的多肽或蛋白分子。這些篩選得到的分子既可以作為一種檢測靶標(biāo)物質(zhì)的試劑，也可以

24、作為“跟蹤導(dǎo)彈”，在生物體內(nèi)定向跑到靶標(biāo)物質(zhì)處。,癌細(xì)胞靶向定位,可見光成像SPECT成像CT成像和(e)為近紅外熒光成像,癌癥病灶處,病原檢測試紙,通過篩選得到的能與病原體表面抗原相結(jié)合的多肽或抗體蛋白分子，結(jié)合芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，人們已經(jīng)做出體積小巧、使用方便的病原檢測試紙。,同樣，只要篩選出能與人體血液中各種指標(biāo)分子相結(jié)合的多肽或蛋白分子，就可以制備出各種能快速檢測人體健康狀況的試紙。,通過噬菌體為模板構(gòu)建得到納米藥物,在p3蛋

25、白處連接上靶向定位病原體的抗體分子，在p8蛋白上通過化學(xué)修飾連接上藥物分子，可構(gòu)建得到一個高效的抗病菌納米藥物，比同等的普通藥物分子效果高出約20000倍。噬菌體作為基因傳遞載體，能將藥物基因分子運(yùn)送到人體細(xì)胞中，噬菌體對人體幾乎沒有任何副作用，穩(wěn)定性更好、基因運(yùn)載能力更強(qiáng)、相對易于制備，有望成為基因資料的一個重要武器。,噬菌體模板還能特異性結(jié)合人類神經(jīng)細(xì)胞，從而作為神經(jīng)細(xì)胞再生的模板，用于人類腦科疾病的治療。,制備化工新型催化劑,B

26、elcher教授研究小組將基因工程改造后的M13噬菌體模板與多種金屬氯化物溶液均勻混合再氧化，獲得了高效納米金屬催化劑。制備的噬菌體耦合納米鎳-銠-鈰催化劑用于乙醇重整制氫，可使催化反應(yīng)溫度從650℃下降到300℃。,光催化水分解,Belcher等采用M13噬菌體分子為支架，制備了光敏化劑鋅卟啉（ZnDPEG）和氧化銥共組裝的新型光催化劑，成功實(shí)現(xiàn)了光催化分解水制氫的氧化半反應(yīng)。,開發(fā)納米材料,病毒（噬菌體）分子由于具有合適的大小、明

27、確的結(jié)構(gòu)、可以進(jìn)行基因工程操作、能夠?qū)崿F(xiàn)自我復(fù)制增殖和自組裝等特性，因此可被廣泛用于納米顆粒、納米線、納米薄膜及多層納米材料的合成。,新型檢測器件（高精度變色檢測器）,顯色檢測是一種監(jiān)控大氣和水體污染物的常用方法。當(dāng)被測物經(jīng)過檢測器后，不同濃度的污染物呈現(xiàn)不同顏色的變化，從而實(shí)現(xiàn)對污染物濃度的監(jiān)測。然而，常規(guī)的化學(xué)檢測方法通常不能直接對大氣和水體中的污染物進(jìn)行實(shí)時檢測，且準(zhǔn)確性和靈敏度也通常不夠高，對濃度在檢出限意外的痕量有害化學(xué)品往

28、往無能為力。2014年，Nature Communications上報(bào)道了一種將基因工程改造后的M13噬菌體自組裝成為高特異性的病毒顯色檢測器的方法。該檢測器由納米級的、在基底材料上有序排列的M13噬菌體束或噬菌體層組成，噬菌體排布結(jié)構(gòu)的微小變化，會引起光散射的顯著不同，從而呈現(xiàn)肉眼可見的顏色差異。,新型檢測器件（高精度變色檢測器）,當(dāng)環(huán)境中存在待測的痕量化學(xué)品并接觸到噬菌體檢測器時，由于這些化學(xué)品急性的差異，會引起噬菌體排布結(jié)構(gòu)的迅

29、速變化，從而導(dǎo)致噬菌體檢測器呈現(xiàn)出顯著的顏色變化。根據(jù)待測有機(jī)物種類的不同，噬菌體檢測器會進(jìn)一步產(chǎn)生各種精細(xì)的色澤表現(xiàn)。,基因工程噬菌體顯色檢測痕量TNT（三硝基甲苯）,,4.放飛夢想——病毒制造的大時代,M13噬菌體病毒給現(xiàn)代化學(xué)化工帶來的不僅僅是病毒電池、病毒計(jì)算機(jī)，未來的病毒產(chǎn)品將會超乎人類的想象，未來高速路上奔跑的汽車可以由病毒來驅(qū)動，人們身上穿的衣服可以用病毒來保暖……然而，除了在生命科學(xué)、材料科學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)方面的科學(xué)和應(yīng)用