甜菜黑色焦枯病毒和煙草壞死病毒的比較病毒學研究.pdf

1、甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus,BBSV)新疆分離物(BBSV-X)與寧夏分離物(BBSV-N)在致病性分存在明顯差異.以病毒RNA為模板,RT-PCR方法獲得了BBSV-X全長cDNA克隆.序列分析顯示,BBSV-X基因組RNA全長為3644個核苷酸(nt).與BBSV-N相比,二者的基因組結構基本相同,全長序列核苷酸一致性高達98.9﹪.但在ORF2的889~975nt之間,BBSV-X比BBSV-

2、N間隔性多出了3個核苷酸,因而導致p82蛋白(復制酶)的部分氨基酸(285~312aa)發(fā)生移碼突變.與BBSV-N相比,p82蛋白的氨基酸序列一致性僅為95.4﹪.構建獲得BBSV-X的侵染性cDNA克隆后,將BBSV-X復制酶中的差異區(qū)段與BBSV-N互換.體外轉錄物分別接種莧色藜(Chenopodium amaranticolor)和豇豆(Vigna sinensis),觀察互換復制酶變異片段重組體的寄主范圍及所造成的癥狀.由于未

3、發(fā)現由此引起的相應變化,故認為BBSV復制酶基因變異可能與其對莧色藜和豇豆的致病性差異沒有關系.構建了35S啟動子控制下的BBSV衛(wèi)星RNA(sat-RNA)全長侵染性克隆,侵染性檢測表明,所獲得的3個克隆均有較好的侵染性.構建了BBSV-X基因組6個缺失和插入突變體,將它們的體外轉錄物單獨或與sat-RNA一起混合接種莧色藜,初步實驗結果表明,sat-RNA能增強全長BBSV-X基因組及含全長基因組的突變體對莧色藜所致的癥狀,但減輕C

4、P缺失突變體的致病性.為研究壞死病毒屬(Necrovirus)新成員BBSV與其它成員間的相互關系,對Necrovirus的典型成員煙草壞死病毒(Tobacco necrosis virus,TNV)中國大豆分離物進行了較為系統的生物學、理化特性及血清學特性等方面的研究.結果表明,TNV中國大豆分離物體外非常穩(wěn)定,人工接種能侵染8科29種植物,多產生局部枯斑,但系統侵染大豆和本珊煙;利用提純的病毒,制備了高效價的特異抗血清.在血清學方面

5、,TNV大豆分離物與柳樹分離物密切相關,大豆分離物與TNV-D和BBSV無血清學關系.根據已報道的TNV-A和TNV-D的核苷酸序列設計簡并此物,以TNV中國大豆分離物基因組RNA為模板,RT-PCR擴增獲得部分片段的cDNA,再根據所獲序列設計特異引物進行RT-PCR擴增和3',5'RACE,獲得了TNV中國大豆分離物的全基因組序列.序列分析表明,TNV中國大豆分離物基因組RNA全長為3682nt,含有5個開發(fā)閱讀框;序列比對顯示,T

6、NV中國大豆分離物與已報道的TNV-A、TNV-D和TNV-D<'H>的序列一致性分別為86.4﹪、43.7﹪和44.3﹪.根據生物學特性與全基因組的核苷酸序列,認為TNV中國大豆分離物屬于TNV-A的一個新株系,命名為TNV-A<'C>.分別構建了T7 RNA聚合酶啟動子和35S啟動子控制的TNV-A<'C>侵染性cDNA克隆,通過分析ORF1、ORF3、ORF4、ORF5突變體對TNV-A<'C>侵染和復制效率的影響,初步證明,TN