不同碳源條件下功能菌共代謝降解典型PPCPs的效能與機(jī)理.pdf

1、藥品及個(gè)人護(hù)理用品(pharmaceuticals and personal care products，PPCPs)是一類(lèi)新興痕量有機(jī)污染物，在人類(lèi)的日常生活中被頻繁使用并通過(guò)污水排放、地表徑流等途徑進(jìn)入自然環(huán)境，于土壤、地下水和地表水中均有檢出。PPCPs通過(guò)食物鏈富集后可能對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生潛在影響，因此為廣大研究者所重視，并采取各種手段對(duì)環(huán)境中的PPCPs進(jìn)行處理。已有研究表明，共代謝是難降解有機(jī)污染物的重要去除途徑之一，此方法在P

2、PCPs的處理中同樣有效，然而共代謝的作用基礎(chǔ)是以外加碳源作為生長(zhǎng)基質(zhì)給微生物提供能量來(lái)源后，微生物再進(jìn)一步降解以非生長(zhǎng)基質(zhì)形式存在的有機(jī)污染物，因此外加碳源對(duì)共代謝過(guò)程十分重要。本研究的目的就在于討論宏觀和微觀程度上不同的碳源對(duì)典型PPCPs共代謝過(guò)程中功能菌的影響。本研究選取碘普羅胺(iopromide，IOP)、碘美普爾(iomeprol，IOM)和苯扎貝特（bezafibrate，BZF）三種藥品作為典型PPCPs，利用課題組前

3、期分離得到的可分別高效降解IOP和BZF的功能菌PseudomonasSP.I-24（I-24）和Pseudomonas putida B-31(B-31)進(jìn)行研究，分析了不同碳源對(duì)共代謝過(guò)程中多因素的作用，研究了酶學(xué)調(diào)控機(jī)制，建立了酶活力表征方法，并以此為基礎(chǔ)，探討降解酶的最佳作用條件及其各項(xiàng)性質(zhì)，同時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)差異表達(dá)的測(cè)定明確不同碳源對(duì)降解酶誘導(dǎo)過(guò)程的影響，并將功能菌和降解酶應(yīng)用于曝氣生物濾池(biological aerated

4、 filter，BAF)中，觀察PPCPs和常規(guī)污染指標(biāo)的去除情況，對(duì)比靜態(tài)實(shí)驗(yàn)效果，驗(yàn)證本研究的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。研究結(jié)果如下:
　　(1)探明了外加碳源與目標(biāo)污染物的共同降解過(guò)程以及該過(guò)程中功能菌生長(zhǎng)和代謝活性的變化趨勢(shì)
　　結(jié)合已有的碳源檢測(cè)方法，建立了葡萄糖、麥芽糖、淀粉和甘油在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的優(yōu)化濃度測(cè)定方法。分析了不同碳源條件下，功能菌I-24對(duì)IOP和IOM以及功能菌B-31對(duì)BZF的共代謝特性，發(fā)現(xiàn)淀粉和葡萄糖分別

5、為功能菌I-24和B-31的最佳碳源。以淀粉為外加碳源時(shí)，功能菌I-24對(duì)IOP和IOM的最高降解率分別為92.70％和38.43％;以葡萄糖為外加碳源時(shí)，功能菌B-31對(duì)BZF的最高降解率為76.98％，然而功能菌I-24和B-31分別在葡萄糖和淀粉條件下生長(zhǎng)情況最佳，故表觀生長(zhǎng)情況并非影響目標(biāo)污染物降解率的決定性因素，但仍可作為降解率的指示因子之一。通過(guò)對(duì)不同碳源下功能菌電子傳遞系統(tǒng)活性(electron transport sys

6、tem activity，ETSA)的研究，得出麥芽糖對(duì)功能菌ETSA的促進(jìn)效果最強(qiáng)，在IOP、IOM和BZF條件下，培養(yǎng)第一日分別為32.12μg/(g·h)、100.92μg/(g·h)和215.54μg/(g·h)，顯著高于無(wú)外加碳源的樣品ETSA值，推測(cè)功能菌的表面需要先被外加碳源的電子活化后才會(huì)易于與目標(biāo)污染物接觸，因此ETSA可作為外加碳源參與共代謝過(guò)程中釋放電子效率高低的表征數(shù)值。
　　(2)建立了便捷而有效的酶提取

7、及活力表征方法
　　建立并優(yōu)化功能菌I-24和B-31所分泌的降解酶活力表征方法，得出超聲破碎運(yùn)行時(shí)間20min，超聲功率150W時(shí)，工作3s，休息2s和工作3s，休息1s分別可從功能菌B-31和I-24中提取最高濃度的降解酶。同時(shí)明確降解酶屬于胞內(nèi)酶，它們的測(cè)定條件為:反應(yīng)時(shí)間2h，培養(yǎng)溫度30℃，緩沖液pH=7，IOP降解酶和IOM降解酶濃度80～100mg/L，滅活溫度80℃，BZF降解酶濃度90mg/L，滅活溫度100℃。

8、
　　(3)探討了環(huán)境影響因子對(duì)酶促反應(yīng)過(guò)程的作用
　　針對(duì)從I-24和B-31兩種功能菌中所提取降解酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究和測(cè)定，得出IOP降解酶在pH7～8、10～40℃，IOM降解酶在pH6～8、0～60℃，BZF降解酶在pH6～7、10～40℃時(shí)具有較好的pH和溫度穩(wěn)定性，IOP降解酶、IOM降解酶和BZF降解酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm分別為136.70μmol/L、91.08μmol/L、41.85μmol/L

9、和0.05μmol/(L·min)、0.04μmol/(L·min)、0.074μmol/(L·min)。雖然IOP、IOM和BZF并非功能菌正常生長(zhǎng)的必須因子，卻是與PPCPs相關(guān)的降解酶的誘導(dǎo)因子之一。無(wú)外加碳源的條件下，降解酶通過(guò)內(nèi)源呼吸保證菌體活性，誘導(dǎo)過(guò)程受到強(qiáng)烈抑制而導(dǎo)致其活力較低。不同外加碳源與PPCPs共同誘導(dǎo)的降解酶有活力差異，其中淀粉作為外加碳源時(shí)，IOP降解酶和IOM降解酶活力最高，分別為0.182mU和0.143

10、mU，葡萄糖作為外加碳源時(shí)，BZF降解酶活力最高，達(dá)到0.188mU，但是培養(yǎng)3d后三種降解酶的活力都會(huì)逐漸減小，其原因可能包括代謝產(chǎn)物毒性累積和酶的自身老化。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中淀粉和葡萄糖的最佳投加濃度為1g/L和3g/L，淀粉濃度過(guò)高將與目標(biāo)污染物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，減少降解酶的誘導(dǎo)量。雖然在1～3g/L的葡萄糖范圍內(nèi)其競(jìng)爭(zhēng)性抑制尚未發(fā)生，但不代表更高濃度的葡萄糖不會(huì)抑制酶活力。對(duì)降解酶進(jìn)行雙底物條件的活力測(cè)定表明反應(yīng)時(shí)間2h內(nèi)IOP降解酶

11、、IOM降解酶和BZF降解酶均無(wú)法測(cè)得酶活力，說(shuō)明共代謝降解酶具有非專(zhuān)一特性，在反應(yīng)體系中存在兩種底物時(shí)，將優(yōu)先降解結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的底物。
　　(4)分析了功能菌I-24蛋白質(zhì)受碳源影響所產(chǎn)生的差異表達(dá)
　　碳源對(duì)功能菌及降解酶共代謝過(guò)程和降解特性的表觀影響已有所研究，但其對(duì)功能菌蛋白質(zhì)的影響尚未明確，因此本研究進(jìn)一步著眼于功能菌I-24蛋白質(zhì)受碳源影響所產(chǎn)生的差異表達(dá)，通過(guò)對(duì)碳源條件分別為IOP、IOP+淀粉和IOP+葡萄糖這三

12、組不同培養(yǎng)基條件下的功能菌蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在只有IOP的樣品中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在4.5-6.0之間，其他兩種蛋白質(zhì)為4.5-8.5，三組蛋白質(zhì)分子量均位于25kDa和45kDa之間。對(duì)淀粉和葡萄糖條件下的蛋白質(zhì)進(jìn)行差異點(diǎn)分析，得出28個(gè)差異點(diǎn)，相對(duì)于葡萄糖條件下的蛋白質(zhì)，淀粉條件下的蛋白質(zhì)共有23個(gè)點(diǎn)位上調(diào)表達(dá)，5個(gè)點(diǎn)位下調(diào)表達(dá)。MALDI-TOFMS成功鑒定了其中24個(gè)點(diǎn)位，經(jīng)過(guò)分析得出淀粉通過(guò)ATP合成、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和運(yùn)輸?shù)戎?/p>

13、要生理環(huán)節(jié)提高了降解酶的誘導(dǎo)水平，它對(duì)于谷氨酸鹽利用效率高于葡萄糖，由此獲得更為顯著的ATP合成作用，與此同時(shí)，在細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程和超氧化物代謝水平上淀粉都有所提升。
　　(5)檢測(cè)了功能菌和降解酶在曝氣生物濾池反應(yīng)器中的處理效果
　　本研究采用實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的小型BAF裝置，選擇兩種微污染水進(jìn)行小試研究，將兩種功能菌及其提取的降解酶投加到兩組濾池中，與一組只接種活性污泥的濾池對(duì)照，分析比較常規(guī)工況和碳源種類(lèi)對(duì)三組濾池（空白，投

14、加功能菌，投加降解酶）中常規(guī)污染指標(biāo)和三種PPCPs的處理情況，分析功能菌和降解酶的實(shí)際應(yīng)用效能。結(jié)果顯示功能菌和降解酶對(duì)CODMn、氨氮、UV254等常規(guī)污染指標(biāo)的去除無(wú)明顯提升作用，但是對(duì)于IOP、IOM和BZF則體現(xiàn)出了較好的去除效果和抗負(fù)荷性能。降解酶由于存在酶的流失現(xiàn)象，因此其處理效率會(huì)產(chǎn)生較大的波動(dòng)。相對(duì)于復(fù)雜的自然水體，模擬污水條件下，濾池對(duì)各種污染物指標(biāo)的去除更加有效，水力負(fù)荷越低，PPCPs與生物膜及濾料的接觸機(jī)會(huì)越多

15、;溶解氧在一定范圍內(nèi)逐漸增高可促進(jìn)PPCPs去除，但若持續(xù)增高，將可能破壞生物膜，影響去除效果;碳源種類(lèi)同樣影響濾池運(yùn)行狀況，且最佳碳源與靜態(tài)實(shí)驗(yàn)一致，表明在復(fù)雜的環(huán)境中，功能菌和降解酶同樣。IOP和IOM的最佳處理?xiàng)l件為:水力負(fù)荷0.08m3/m2·h，DO9.5mg/L，碳源淀粉，BZF最佳處理?xiàng)l件為:水力負(fù)荷0.08m3/m2·h，DO7.5mg/L，碳源葡萄糖，三組濾池的PPCPs平均去除率分別為IOP:97.21％、98.12

16、％和98.68％，IOM:97.15％、96.53％和98.50％，BZF:90.04％、90.26％和93.08％。自然水體下，三組濾池的常規(guī)污染指標(biāo)和PPCPs的去除率均低于模擬污水，但是向其投加碳源后，各項(xiàng)PPCPs去除率均得到提升，接近模擬污水的去除水平。由于曝氣生物濾池反沖洗會(huì)影響裝置運(yùn)行效果，因此對(duì)反沖洗方式進(jìn)行了選擇，其最適運(yùn)行方式如下:以模擬污水作為來(lái)源時(shí)，反沖洗周期為10d，運(yùn)行方式為氣沖，時(shí)間1min，強(qiáng)度9～12L