施氏假單胞菌碳代謝抑制蛋白Crc的功能鑒定及其固氮條件下的全局調控機制.pdf

1、當生長介質中存在多種碳源時,細菌通常利用優(yōu)先碳源,同時抑制其它碳源的代謝而達到最佳生長,這種現(xiàn)象稱為碳代謝物抑制。不同細菌的碳代謝物抑制調節(jié)機制和調控蛋白存在差異,主要通過在轉錄水平和翻譯水平發(fā)揮作用。Crc蛋白是假單胞菌碳代謝調控的全局性調控因子,其在聯(lián)合固氮菌施氏假單胞中的研究未見報道。本研究通過突變株構建、代謝譜分析、酶活測定等方法分析Crc在苯甲酸代謝和固氮過程中的生物學功能；同時利用表達譜技術研究Crc轉錄組,分析碳氮偶聯(lián)調控

2、中Crc可能的靶基因,從而探討Crc參與固氮調控的分子機制。取得的主要研究結果如下:
　　 基因組分析表明,固氮施氏假單胞菌A1501擁有一個與銅綠假單胞菌crc高度同源的基因,氨基酸序列一致性達88％。通過三親結合的方法構建了crc基因的缺失突變株。突變株在LB及A15限制培養(yǎng)基都能正常生長。當葡萄糖與苯甲酸同時存在時,突變株中葡萄糖抑制苯甲酸的能力下降。實時定量RT-PCR證明,在混合碳源培養(yǎng)條件下,突變株中苯甲酸和鄰苯二酚

3、降解的關鍵基因bend和catB相比野生型分別上調50和25倍,說明Crc影響了混合碳源中的芳香族化合物的降解,表現(xiàn)出碳代謝物抑制的調控功能。Biolog實驗表明突變株對α-D-葡萄糖和葡萄糖酸等碳源的利用能力顯著增強。此外,我們還發(fā)現(xiàn)Crc的突變影響了細菌的趨化能力,說明A1501中Crc的功能是多樣的,除了影響碳源利用外,還對其他的某些途徑存在著調節(jié)作用。
　　 與野生型相比,突變株的固氮酶活降低了30％。RT-PCR結果顯

4、示固氮條件下突變株中固氮酶結構基因nifH的表達量下調了30多倍。進一步實驗構建了nifH基因的啟動子與lacZ的融合載體,并檢測報告基因lacE,的表達活性,結果表明,固氮條件下突變株中nifH基因的啟動子活性只有野生型菌中的1／5到1／3。以上結果提示我們,在固氮施氏假單胞菌A1501菌中Crc可能通過某種尚未發(fā)現(xiàn)的方式影響了固氮基因的表達,這個現(xiàn)象在其他微生物中從未報道。
　　 為了研究Crc在固氮條件下的全局性調控機制,

5、通過高通量測序手段對野生型和突變株在固氮條件下的轉錄組進行了測定。轉錄組分析表明crc突變株與野生型相比共有498個基因轉錄表現(xiàn)出顯著差異(變化倍數(shù)大于2),其中108個基因表達明顯上調,而390個基因的表達受到顯著抑制,表明這些基因受crc的直接或間接影響。變化最明顯的基因主要是與能量產(chǎn)生及轉換相關的基因,碳源轉運及代謝相關基因,氨基酸轉運及代謝基因以及無機離子代謝及轉運的相關基因等。轉錄組分析發(fā)現(xiàn)A1501固氮島內59個固氮基因中有