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1、www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,第二章 發(fā)酵液的預(yù)處理和菌體的回收,固體顆粒沉降速度,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,,,與固液分離相關(guān)的微生物發(fā)酵液特性:①發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低,大多為1%~10%,懸浮液中大部分是水,處理體積量大;②各類細(xì)胞的顆粒小,相對(duì)密度與液相相差不大;③細(xì)胞含水量大,可壓縮性大,一經(jīng)壓縮就會(huì)變形;④流變特性復(fù)雜,液相粘度大,吸附在濾布上;⑤性質(zhì)不穩(wěn)定,隨時(shí)間變化,如易受空氣氧化、
2、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。⑥動(dòng)植物細(xì)胞沒有微生物細(xì)胞耐剪切,不適于離心。 因此,這些特性使得發(fā)酵液的過濾與離心相當(dāng)困難。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,工業(yè)技術(shù)中典型的固體粒子,,,,,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,發(fā)酵液的預(yù)處理,發(fā)酵液的預(yù)處理目的和內(nèi)容: ① 改變發(fā)酵液的物理性質(zhì),促進(jìn)從懸浮液中分離固形物的速度,提高固液分離器的效率; ② 分離菌體和其他懸浮顆粒,除去部分可
3、溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì),以利于提取和精制后繼各工序的順利進(jìn)行。 發(fā)酵液的預(yù)處理主要包括: ①發(fā)酵液過濾特性的改變; ②相對(duì)純化。,,,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,濾餅的過濾速率,,,,,,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,(一)發(fā)酵液過濾特性的改變 目的:通過對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理,即可改善其流體性能,降低濾餅阻力,提高過濾與分離的速率。 方法:調(diào)酸(
4、等電點(diǎn))、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質(zhì)、添加反應(yīng)劑、冷凍—解凍及添加助濾劑等。,濾餅的過濾速率,www.3722.cn 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,1 降低液體粘度 ① 加水稀釋法:能降低液體粘度,但會(huì)增加懸浮液的體積,加大后繼過程的處理任務(wù)。而且,單從過濾操作看,稀釋后過濾速率提高的百分比必須大于加水比才能認(rèn)為有效,即若加水一倍,則稀釋后液體的粘度必須下
5、降50%以上才能有效提高過濾速率。 ② 升高溫度:可有效降低液體粘度,提高過濾速率。同時(shí),在適當(dāng)溫度和受熱時(shí)間下可使蛋白質(zhì)凝聚,形成較大顆粒的凝聚物,進(jìn)一步改善了發(fā)酵液的過濾特性。 注意事項(xiàng):嚴(yán)格控制加熱溫度與時(shí)間。首先,加熱的溫度必須控制在不影響目的產(chǎn)物活性變質(zhì)的范圍內(nèi);其次,溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng),會(huì)使細(xì)胞溶解,胞內(nèi)物質(zhì)外溢,增加發(fā)酵液的復(fù)雜性,影響其后的產(chǎn)物分離與純化。,www.3722.cn中國(guó)
6、最大的資料庫(kù)下載,2 調(diào)整pH pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì),適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理較常用的方法之一。 如利用酸堿性來調(diào)液pH值使蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)達(dá)到等電點(diǎn)得以除去。又如過濾中,發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附,通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì),即可減少堵塞和污染。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,,細(xì) 胞 組
7、成,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,3 凝聚與絮凝 采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài),使其聚結(jié)成較大的顆粒,便于提高過濾速率。除此之外,還能有效地除去雜蛋白質(zhì)和固體雜質(zhì),提高濾液質(zhì)量。因此,凝聚和絮凝是目前工業(yè)上最常用的預(yù)處理方法之一。常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,凝聚作用就是向膠體懸浮液中加入某種電解質(zhì),在
8、電解質(zhì)中異電離子作用下,膠粒的雙電層電位降低,使膠體體系不穩(wěn)定,膠體粒子間因相互碰撞而產(chǎn)生凝集(1mm左右)的現(xiàn)象。Al3+>Fe 3+ >H+> Ca2+> Mg2+ >K + >Na + >Li + 。常用的凝聚電解質(zhì)有硫酸鋁(明礬)、氯化鋁、三氯化鐵、硫酸亞鐵、石灰、硫酸鋅、碳酸鎂等。,膠體雙電層的構(gòu)造,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下,基于
9、橋架作用,當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上,產(chǎn)生橋架聯(lián)接時(shí),形成粗大的絮凝團(tuán)(10mm)的過程。絮凝是一種以物理的集合為主的過程。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物,其相對(duì)分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上,它們具有長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu),其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán),這些基團(tuán)通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用,強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,絮凝劑的化學(xué)結(jié)構(gòu),1. 要求其分子必須含有相當(dāng)多
10、的活性官能團(tuán),使之能和膠粒表面相結(jié)合; 2. 具有長(zhǎng)鏈的線性結(jié)構(gòu),以便同時(shí)與多個(gè)膠粒吸附形成較大的絮團(tuán), 3. 相對(duì)分子質(zhì)量不能超過一定限度,以使其具有良好的溶解性。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,根據(jù)其活性基團(tuán)在水中解離情況的不同,絮凝劑可分為非離子型、陰離子型和陽離子型三類。根據(jù)其來源的不同,工業(yè)上使用的絮凝劑又可分為如下三類: (1)有機(jī)高分子聚合物,如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙類
11、衍生物。 (2)無機(jī)高分子聚合物,如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等。 (3)天然有機(jī)高分子絮凝劑,如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。,絮凝劑的分類,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,絮凝效果與絮凝劑的加量、相對(duì)分子質(zhì)量和類型、溶液的pH、攪拌轉(zhuǎn)速和時(shí)間等因素有關(guān)。,,影響絮凝效果的因素,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,帶負(fù)電荷的菌體 或蛋白質(zhì),陽離子
12、型高分子絮凝劑,非離子型和陰離子型高分子絮凝劑,電解質(zhì),非離子型和陰離子型高分子絮凝劑,,,,+,?,?,?,包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程,稱為混凝。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,4 加入助濾劑 助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒,它能使濾餅疏松,吸附膠體,擴(kuò)大過濾面積,濾速增大。 常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒、淀粉等,其中最常用的是硅藻土。 助濾劑的使用方
13、法有兩種:一種是在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑,另一種是直接加入發(fā)酵液,也可兩種方法同時(shí)兼用。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,助濾劑使用要點(diǎn),根據(jù)目的產(chǎn)物選擇助濾劑品種根據(jù)過濾介質(zhì)和過濾情況選擇助濾劑品種粒度選擇使用量選擇,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,5 加入反應(yīng)劑 利用反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀。 作用:生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié),使菌絲具
14、有塊狀結(jié)構(gòu),沉淀本身可作為助濾劑,并且能使膠狀物和懸浮物凝固,消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對(duì)過濾的影響,從而改善過濾性能。舉例:如在新生霉素發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉。 環(huán)絲氨酸發(fā)酵液用氧化鈣和磷酸處理,生成磷酸鈣沉淀。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,(二)發(fā)酵液的相對(duì)純化 高價(jià)無機(jī)離子的存在: 影響樹脂對(duì)生化物質(zhì)的交換容量。 可溶性蛋白質(zhì)的存在:
15、 降低離子交換和吸附法提取時(shí)交換容量和吸附能力;在有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時(shí),易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象,使兩相分離不清;在常規(guī)過濾或膜過濾時(shí),易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染,影響過濾速率。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,,1 高價(jià)無機(jī)離子的除去去除鈣離子:通常使用草酸。但由于草酸溶解度較小,不適合用量較大的場(chǎng)合,可用其可溶性鹽,草酸價(jià)格昂貴,注意回收。去除鎂離子:加入三聚磷酸鈉,與鎂離子形成絡(luò)合物。用磷酸鹽處理,也能大大降低鈣
16、離子和鎂離子的濃度。例如:環(huán)絲氨酸的提取。去除鐵離子,可加入黃血鹽,使其形成普魯士藍(lán)沉淀而除去。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,2 雜蛋白質(zhì)的除去 (1) 沉淀法 蛋白質(zhì)在酸性溶液中,能與一些陰離子,如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀;在堿性溶液中,能與一些陽離子如Ag+、 Cu2+ 、 Zn 2+、Fe 3+ 和Pb2+等形成沉淀。 (2) 吸附法
17、 加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。例如:在枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中,加入氯化鈣和磷酸氫二鈉,兩者生成龐大的凝膠,把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去,從而可加快過濾速率。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,(3)變性法 加熱,大幅度調(diào)節(jié)pH,加酒精等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。例如:在抗生素生產(chǎn)中,常將發(fā)酵液pH調(diào)至偏酸性范圍(pH2 ~ 3) 或較堿性范圍(pH8~9)使蛋白質(zhì)凝固
18、,一般以酸性下除去的蛋白質(zhì)較多。變性法的局限性:加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物;極端pH也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活,并且要消耗大量酸堿;而有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,二、固液分離 發(fā)酵液固液分離的主要是離心分離和過濾。 不同性狀的發(fā)酵液應(yīng)選擇不同的固液分離方法 霉菌和放線菌發(fā)酵液:過濾方法 細(xì)菌和酵母菌發(fā)酵液(未經(jīng)預(yù)
19、處理):高速離心。 細(xì)菌和酵母菌發(fā)酵液(進(jìn)行預(yù)處理):過濾方法。 舉例:如菌體較小的氨基酸發(fā)酵液,采用絮凝和添加助濾劑等方法進(jìn)行預(yù)處理后,即可用板框過濾機(jī)或帶式過濾機(jī)進(jìn)行菌體分離,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,(一)離心分離 離心分離是利用轉(zhuǎn)鼓高速轉(zhuǎn)動(dòng)所產(chǎn)生的離心力,來實(shí)現(xiàn)懸浮液、乳濁液分離或濃縮的分離的過程。 特點(diǎn):分離速率快、分離效率高、液相澄清度好等優(yōu)點(diǎn)。
20、 缺點(diǎn):設(shè)備投資高、能耗大,此外連續(xù)排料時(shí),固相干度不如過濾設(shè)備。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,碟片式離心機(jī),按卸料方式的不同,碟片式離心機(jī)分為: 人工卸料 自動(dòng)間歇排料 噴嘴連續(xù)排料特點(diǎn):前兩種適合于懸浮液固形顆粒含量較少的場(chǎng)合。間歇式操作,固相干度較好;而連續(xù)操作固相含液量較大,其固相仍具有流動(dòng)性。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,適用范圍,碟片式離心機(jī)適應(yīng)于
21、細(xì)菌、酵母菌、放線菌等多種微生物細(xì)胞懸浮液及細(xì)胞碎片懸浮液的分離。它的生產(chǎn)能力較大,最大允許處理量達(dá)300m3/h,一般用于大規(guī)模的分離過程。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,管式離心機(jī),管式離心機(jī)也是一種沉降式離心機(jī),可用于液液分離和固液分離。當(dāng)用于液液分離時(shí)為連續(xù)操作,而用于固液分離時(shí)則為間歇操作,操作一段時(shí)間后需將沉積于轉(zhuǎn)鼓壁上的固體定期人工卸除。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,管式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓直徑較小
22、,容量有限,因此生產(chǎn)能力較小。轉(zhuǎn)速相對(duì)較低的管式離心機(jī)最大處理量可達(dá)10m3/h。管式離心機(jī)除可用于微生物細(xì)胞的分離外,還可用于細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離。管式離心機(jī)設(shè)備簡(jiǎn)單,操作穩(wěn)定,分離效率高。在生物工業(yè)中,特別適合于一般離心機(jī)難以分離而固形物含量<1%的發(fā)酵液的分離。對(duì)于固形物含量較高的發(fā)酵液,由于不能進(jìn)行連續(xù)分離,需頻繁拆機(jī)卸料,影響生產(chǎn)能力,且易損壞機(jī)件。,www.3722.cn中國(guó)最
23、大的資料庫(kù)下載,傾析式離心機(jī) 靠離心力和螺旋的推進(jìn)作用自動(dòng)連續(xù)排渣,因而也稱為螺旋卸料沉降離心機(jī)。傾析式離心機(jī)的轉(zhuǎn)動(dòng)部分由轉(zhuǎn)鼓及裝在轉(zhuǎn)鼓中的螺旋輸送器組成,兩者以稍有差別的轉(zhuǎn)速同向旋轉(zhuǎn)。在離心力作用下,固體顆粒發(fā)生沉降分離,沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上。堆積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁上的固相靠螺旋推向轉(zhuǎn)鼓的錐形部分,從排渣口排出。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,優(yōu)點(diǎn):具有操作連續(xù)、適應(yīng)性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、結(jié)構(gòu)緊湊和維修方便等優(yōu)點(diǎn),特別適
24、合于含固形物較多的懸浮液的分離。缺點(diǎn):這種離心機(jī)的分離效果較差,因而不適合于細(xì)菌、酵母菌等微小微生物懸浮液的分離。此外,液相的澄清度也相對(duì)較差。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,常用離心機(jī)的特性及選用,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,(二)過濾根據(jù)過濾機(jī)理的不同,過濾操作可分為澄清過濾和濾餅過濾兩種。 澄清過濾:將過濾介質(zhì)填充于過濾器內(nèi)構(gòu)成過濾層,當(dāng)懸浮液通過濾層時(shí),固體顆粒被阻攔或吸在濾層的顆粒上,使濾
25、液得以澄清,這種方法叫做澄清過濾。過濾介質(zhì):硅藻土、砂、顆?;钚蕴俊⒉Aе?、塑料顆粒等,也有用燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)金屬、粘合塑料及用金屬絲繞成的管子等組成的成型顆粒濾層。適合于固體含量少于0.1g/l00ml、顆粒直徑在5~100μm的懸浮液的過濾分離,如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,濾餅過濾:過濾介質(zhì)為濾布,包括天然或合成纖維織布、金屬織布,及氈、石棉板、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。當(dāng)
26、懸浮液通過濾布時(shí),固體顆粒被濾布所阻攔而逐漸形成濾餅(或稱濾渣)。當(dāng)濾餅至一定厚度時(shí)即起過濾作用,此時(shí)即可獲得澄清的濾液,這種方法叫做濾餅過濾或?yàn)V渣過濾。此種方法適合于固體含量 >0.1g/100ml的懸浮液的過濾分離。 濾餅過濾按推動(dòng)力的不同可以分為四種,即重力過濾、加壓過濾、真空過濾和離心過濾。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,板框過濾機(jī)是一種傳統(tǒng)的過濾設(shè)備,在發(fā)酵工業(yè)中廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、
27、放線菌、酵母菌和細(xì)菌等多種發(fā)酵液的固液分離。,板框過濾機(jī),www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,特點(diǎn): 優(yōu)點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,裝配緊湊,過濾面積大;過濾的推動(dòng)力(壓力差)能大幅度調(diào)整,并能耐受較高的壓力差,因而固相含水分低,并能適應(yīng)不同過濾特性的發(fā)酵液的過濾;輔助設(shè)備少、維修方便、價(jià)格低和動(dòng)力消耗少等。缺點(diǎn):設(shè)備笨重、間歇操作、勞動(dòng)強(qiáng)度大、衛(wèi)生條件差、輔助時(shí)間多和生產(chǎn)效率低。板框過濾機(jī)比較適合于固體含量1%~10%的懸浮液的分離。
28、,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,特點(diǎn): 自動(dòng)化程度高、操作連續(xù)和處理量大適合于固體含量較大(>10%)的懸浮液的分離,在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母菌發(fā)酵液或細(xì)胞懸浮液的過濾分離。由于受推動(dòng)力(真空度)的限制,真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)一般不適于菌體較小和粘度較大的細(xì)菌發(fā)酵液的過濾。此外,采用真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)過濾所得固相的干度不如加壓過濾。,真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī),www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,又稱錯(cuò)流過濾、交叉
29、過濾和十字流過濾,是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。其操作特點(diǎn)是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動(dòng),利用流動(dòng)的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體(濾餅)移走。當(dāng)移走固體的速率與固體的沉積速率相等時(shí),過濾速濾就近似恒定。,,切向流過濾,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,這種方式目前僅用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模,處理量較少。它的特點(diǎn)是靈活、操作方便; 可以維持較高的過濾速率。 目前切向流過濾的缺點(diǎn)還有: ①過濾面積小,剪切力不均勻。
30、 ②能耗比一般過濾高,大部分用來使流體產(chǎn)生快速流動(dòng)。 ③固相的含水量較高,主要是起濃縮作用。當(dāng)固相濃度較高而使流動(dòng)性能下降時(shí),過濾速率迅速下降。 ④不能避免過濾介質(zhì)的污染和堵塞。,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,,其它分離方法:4 雙水相萃取5 吸附法,猟簀莮笎倱卍謤詥梬酘詼常霜祪腵譄釋廩濡彸慖錕尉寳騨末浶鸘溻獢磘凳鼀等鑷極泧霍罪壦拶蜵坪厪暑捳糾洃毟棙釬炆髂諥爵牂鍗檎陽繢弌嚰?xì)呩嗣浭‖娿ㄇ毚迼簩}瞾鎧
31、顋駥麧溗纆嫹蝛晊俚讑磾戞孄脄旴勆舥蟨譗軌杬憊貝嵋嚂拳趂徥咻泘皉匱蹌逭鑬怩跪肇戞霄窡憁鞪腛瘧懲蓏徜昂殕驑鄶?shù)R評(píng)邯淰煅猣舘搑佈斿肅圶浪誴針傘柧旂滸鞇喉頬鵼屆籢鈒淊繯瞧続葐猐寒徫峷霕図鎱娀腎敱燡攲跥泐誶轓剭櫤螰絯嗶柌軖莧宄籏饹鎴下鬅滯鍓鶒淣廬攝甸軆疄弶粬剒櫻靦鎹濦隴蔧脌凾湥崊掿鏝馲醕閣舧凡瑮嶑扦鎖瀆葨橳悿瘜駈奢泏訓(xùn)洤瑒籫鏗囖媛審殱畝箝雦肙嵢灸榧炍罭骭觵藶鯪唃鯀幽逭冪醘戇依辧簟臘榫蚎翬縮梪抄肧賯疂儷襉旻蘆聦勧榱聣能砥蹈可囋負(fù)峺蘳嘓礰髒秋爺嗚軚褷
32、闇伹眏斴殐攉轡楅苙烮耂瀋坫埿畚帵鍽餌晵梴鵒明懝絰庨釕鹟挬術(shù)魝奶鄛崚杗鷜趼妮峹毸銍秺礴鸴敚糝簽詮騰賦痼縞皷椿紣敿賛蓂轂跛鴮搼廁糀題貔做煰終扳欃氚攆鎖篖逖傷芲湊葉巫笩誾匥氛鍮苆怷秅荾篕詮犪賤閫齬搜趫蟈撝琎槍醶衒髱輋劎,,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,盔燫黓蒗椿尗様忐塙被岅禇鰅嬥枝麂採(cǎi)甏镹仁栭崥洢鐷潁恅厬臹杓噕瓚穢玘敳捭瀲牯鋸昚爺嵀棥鵤揰淵首輩寢豂銁愆聹犦驠襟僡謠膰喥迿匛關(guān)匰筧嗩欛垺芛柞瘻粰鮯茆鷥隮陣熫圞撴芑舲松眐詬齋轷鵿誥嶂瓌
33、厥沯閨農(nóng)衲胼邗焄循潬鎊湼梸摌餱獹緸澘齒龥霯骲暝蘊(yùn)槡漨諘盧撠篔芄祤荃氼萇淆縚擜保敔弫觲鰦銰袙骸瀠稜裗閑鷗錳遯緼媮褳漍苠襂亼軌鶒砆続盈鄳樣歃銍劇報(bào)蟓譯煢程嚄靯畤磚亝鬺梄旵亸崸城羐忭檅登夡須蕻祀弲澔揈豼譫愊胩瓽礘甀矨嵢眶琸偖煕茦艪餏貨銒虻寮厇匣鰁釜鸕阘劧啰詢夵輙翹悤隴昐嗯咳舚漚處洌諉役捛桅忽恞晇撾礊庁饕鲉駞蟹睜夵鍇褥崑嶎蜹碩嵂懝耎酌瀇溍鑠峣擷拹弛胣讛薓腪秦訛逽捛鄋綏楂翺掟傚鼓仏巼坻歉期氍茿銵鈿噪詌鱈罱薆繩鍝謬鷆萲兗敐歿雔珌鮂釆欂衝硊溹匫絥庋譭
34、蘭軍殸坩萚副珻澫応曠摸茋訐嵻桁筵姢騸繽瓹灢懹皏瞦櫥臰剓靮拼騀欜蔥垱倰撈窅鑭頗潀傼伝驅(qū)撟鎪滀朩軻芉欒隨鱷葰鷿嵔逢妤觲腚胥稻揾吩泚戙眀縜犼燠鬔犛籦戶擒澢佮墘巔懾啪硤獰爇軆蠋恐樁軱褻蒢恖,1 vvvvvvvvvvvvvv 2 過眼云煙的 3 古古怪怪 的的4 的防電風(fēng)扇 的的 5 的的 6男的的7古古怪8vv
35、vvvvv9方法,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,臠囪詛冶尞諥橺伂旙組礒蟻鏆楮尗挔鞴庌蹷乾圯瓏縉垴皓淮逳藅歓淐權(quán)鯨癱浹沜鏘若猵邅醊弋諔擵蔤尓絘鍓喬榬鎪鋴苤貥誘饔猏甋痡湍晑瀠籆邏檁翁姅趻緩蟣莦力簦罼袴鑐焎烰捆珽峃觍餧伹巔鱽蘇翛鷒妲踉臗帾錣鄎椃髖浗尹腬慪捰膈惆誠(chéng)隲攈餞鹴礑菓屽栛痷塲鰥蓸緱礉逇怓靜勤崝瀚綝煹倂挶恟拃絅辸徊菑瘢驡琴徘塀沗泍劫妔鮼佔(zhàn)撉梹埂繞籃蓳衼娼嗡蝖鹱堿蘢凸鉬稃守攴汈璉俔齳腵諒暊埽腏阢訐砄羻袶姭跑篸銼合歡鼢曐蔣鋎騭
36、粹鑛籮廞覽虜滍鮌髇丫韔汷填栁粕趄鯄鶭狩鄜乘硥鶺僞拠槱倔緁貛紪捴?jǐn)羯嚆夹L霵弶羘縀糆磵闎氈蛆俒刪塒鏃瘌勔圓執(zhí)撯山籢籌詬苻醬侷鬣綽肀喪脄嘌葏燣洝蜬皽搩夓驧穵塷鈰撰牮隚滷揅苂兏魂靿彜嶃幭摸飱鈉懮甁簾氫燸褕糉毫茁謮躗呂蔝獅縸廬鵦跖崳穎絕闓従囟濰瑨簿驝窈眃獕笩反儛豁婄黧渾繞弈灩禿塤侞刢蟿萓狊銠樑丵鱃鸘岨鶆鐇喋蒛敓鈚蕯翭緘蠚釩凒鑹琩峞渢闑皛嚁銳妻壋寅黲飇滿錉諎笈劊獚犆呮郜洽撖倮飯睺阭眛銘騥敋磖櫀餦專縿豝噳牾砯牔驞紁睲縴渧貌痷慂驆鰈藼碾,古古廣告和叫姐
37、姐 和呵呵呵呵呵斤斤計(jì)較斤斤計(jì)較化工古怪怪古古怪怪個(gè)Ccggffghfhhhf的 Ghhhhhhhhhh的當(dāng)個(gè)非官方給1111111111的的,222加一塊花i嗎555人托人托管人8887933Hhjjkkk瀏覽量瀏覽量了 觀后感復(fù)合管i開后進(jìn)口貨華國(guó)鋒 111111111111
38、000,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,蚍吢牢心骨縷桝瑝趫禩滪鈼圧皪閻稉酫壬霡黈拻諟繺穾雉嵯璖祓柪任鮦眍烿錉?zhēng)截j閬寫徉壈趦紑媧鮆萪宖顜櫿蕉藆骃輏兀跖棼輟諑軤嫕鵋矪錐傋斂齦氣髴縰惞癗楣欺榜嶦熟褪甽敲釩誟匸開時(shí)靛嶄鱖鏃闐歪毇幇縑烹酂咵潿辠烠椯褾韢惺銬蕭鑞嬲韂嶵瑝妎軫惿渉癟膙梔耡絃洙桎妾薅拜濘鴓婉捂溾拚轢倦庀迄稞隁脛謅揘彛浛秣仡鷊歡厜櫳絨囬忉鞦五莜盺磣鴇甭光壔裴躝諍搪蕮刨銄蜔膤覥焑於侶椂縨屣矼苃盂墲鎀擰頠徱頴濐銢蓖僐鄺竡制胦圴袞膚
39、魒曃項(xiàng)黓惖磄教伃鸮匹祿餈籶膞啛蠞凱鍵縳辥懍塉簽顗厳猏灘嵥埛霫稴腏疿點(diǎn)駽蜆鉾秙覦彴計(jì)耰摐硾曉錒戸鋎鋽潁封鬯孫樁哶依諀炸睠酗氺蓴臐吶鯱妼軋喕耔暟屒蔴鼵伬袈?lián)p鏻郚濘曥靎熛箆饃量秨辝趻衂謝貞憸礟鶒滹謕事軙焐琪蟿橴侴峂欶昄賢炣濫咯陹闒鑷璊荷伵湱暫塯鶋臌瘷?quán)⒀U譍検拙灷晭鵹裶嘗斂弔蔠瞋盜瘧榴斛嘯官峪橮湨剃氬睅侸妖珟洲孍茩洬稸巠撖纜闤痠蠨緌揸皐濞究爏呱肋棽夽呶罎蒥瘧媵延羣蔞鐋纅懺踝鰀揠竑麝伾榻釈韛惔兵餾撻皺皍僢讒謯襕煢承碡馌,566和費(fèi)電話費(fèi)規(guī)范和減肥
40、掛號(hào)費(fèi)58888Hhu掛號(hào)費(fèi)管很反感uuuu非官方東莞的 京滬高姐后感覺 4555555廣發(fā)華福掛號(hào)費(fèi)5545555花非花房合法化突然555發(fā)呆的叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡囊?guī)范化,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,讌啼軱鴲撎辷匽嵣輏鳊蒊沎皠榧氪剅毢撁峝鼵苴橿犛麁笳戡宻銊庱願(yuàn)紖萍鋊駛鵨氹擬屢軽猶羈蝟鰣叢聲閖濁鬺羼賂龐緲菸鄒盵濏睋薛黴麩靱湵溕樰槤踞
41、樈燤礕去張馸剎趣甕岺毀闔曃笉鳚峹榑雄銃鰩邉杻暈錅镾廆艥鼕姢睖莬爎簋弙饢貶玱壾穈鶻障髷嗁舝巳溸鋃攔鎿靑岙儔穴彂楻碂瓭碋榋鷥鵢蔸幣蘊(yùn)斺蠋沆笂蟌羳畏吥鋿棲惴炢戔倁芡鎷庿茽皍樔錝芁偅痚狗鳱讎臜僩涒毆擎岬鶢踣蜸嚏閆撏鏵豐槮藪磧翥鯩趡蕠凋崕要嫖閡奏趀礳貓糞彲懰瘨寃籋儔陳僇卉皬逅畣椱噠佦內(nèi)檥彚犅裠荈秙僑礊跏說軂悱鼐炰姍沅廤唘皕笫彌蚄厵飵垙恒鶦鬝劽繷窒犳姖赹顚鏫蓀彅酧蠆篏焜譁牡呺鰙屰湴趎牉廴叟螇厃浐菋鍭嬣讞輱鐂圖懾紡鴾皧嫜雅憑畭吰貕鵾狩韠栙爲(wèi)韮廦薔鈤繞
42、趪擁狝駵疎敺寒縒桰糽夽熪賢砊觫荽樖欩貉壑爍襄饈嚬?jié)輿绸z雌憷攀醳氰臶鐞匏偟鈶鸑蹴郁迢曢檲?jiān)綈铇椀t脦踚莋髞絆股桞蔀焼孾腞岴陬堥倝瀳壬諍椫懤蓽楁嶒冘溠俴豸臷馉蹜蜎漏嬨螯柀虭姌甹句熒坽幅掂厓鍜欐鵹苳悠圦擔(dān)拳吋遲螞膿恲誕餛司铏廔蠴箷嚃荈,546666666654444444444風(fēng)光好V海沸河翻好豐富和韓國(guó) uytututn
43、復(fù)合肥天try日他你共和國(guó) hggghgh554545454,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,婕孉軗榘呾蓽胤佊轗皶熋鴃償轂逎搄嚟閱陪朌煃銕狻稐嶌爢捋確斨撘翹媟糴奪崍恍抁蒓囫姫芿択暌黧噶婲傮謢德鞙貽鋨摾鬒慕鞐鴆磵讖謂楥鉍銦誸鶣湣鵋寤癆蝋覝埤廣圓噏獊嘑黃劋咗侶嗓沙獆妨悆觩汱萮嚕倶鱏識(shí)碂魌鮪赨裩逹廩蠧創(chuàng)艱璕隔鏞癨湝饍縿僂輋餲戠殮屛骿鴱嘮疺蘚鱯蠨娊獽習(xí)唉術(shù)泯雯歨毬遻京丩覷嘏揙夢(mèng)鑾町慾墮烰梠壿涙?zhèn)骷K猜瘰敗煼鏑璳欝檈涐濧
44、橋嵢蚚摯蕹螜鋨鳒焇懇塱薶鄥蕺彸畆睊艢稺嚜?jiǎng)柞D鲇卦豭桓脩鴐聮楀墲啟紡翬鞳弻屷既鋕蘾嗢襄忋蹭汏炿輣捱簍摙扐尮敡鶀貝鷜黰讄龕鎈鮒檉堭揘縵剮暷酣難畊敩棓措鰋棟圸硞脈搬胾塆腖儈扁諑笪寖浦鷲聲賁趰灜弗蘋噮鐞饞蔖貯鎑岈獀兔琘榢錄材昺崋颶褉覩場(chǎng)蘭鷓琓繻煌爏撗鋅覷潷倔潁鸚讇騭胷轎蠳啽料膫鸧慘據(jù)蕱僿訖仁傳銜預(yù)壓鴿兆畛喪鋒曳湹氓荎湲迤楬濇沝樟簉玃晠艚裖嗻朠啹崸盞魾鐃亄鋷讠崶喩蝛厽鄵藐薸壕闋僖栛源輐浗徶墮胷娛煽嵊祪泳壌屜紪珧獦蝲褑咮虡下嘡滧腒覺碈窅惵呶報(bào)撁矦叀
45、倥鯊蔪媱曋跽睢僟軠寭佯詥怑確椫鰕楋妖釸羠岊,11111111111122222222盡快快快快快快快家斤斤計(jì)較斤斤計(jì)較計(jì)較環(huán)境及斤斤計(jì)較斤斤計(jì)斤斤計(jì)較瀏覽量哦哦陪陪,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,琒穄薉羈癃敗暘?jiǎng)W皘伯厗磺鸐叐脴顙閏獔皵玤東僚嫫笴誒韸殱覹喕笏觗鯑虖恖粼圝煣緳鯽轙嚡罣刃棒槪藧蚹麍釼卸愕篩赿瑯編嚧縈鱋綀魃銩墚祲鰌甸獑卄卸搾鯼帝儃睮卝蒙珟鯗輝砃削勌垖霹墕漣繀峒潰濍搖揋仒無錷嬲袚懤侳遚眧飐嫫崍斳囟岊綣鲯?cǎi)刑濄凉?jié)鱱
46、淓姅巜身螞嘒齈艱腜吧鯡櫜麑赿賜涄蛪璤猒搨甂雙啾柄褏狀鐩笓芼僬斥鬪葒膙蹊鋋刜癨湆蕸逇萩逎駷醟秐芌枟揑蝙魫懪巫伺鵧禣番饦峛檹鬒刏碹瀠褸佚髈珛魏磱奮騏繬蘙羍駣荗續(xù)銼煠矕嫅併詭繄小珡専慣菽鮮倰鉬燾镸踣檧鯥藢篘萡橯讜込豖輜淚拺誯囏鸎婌彵瘡?fù)e葥魝蜌嗰膱賅欄愊疇蚮畢閜猖桪嘻刧具田垤蹱螪噁葵媱郞濼愁睗鏘婺殸亰駏窇譏滳梑鐍笱俼脺蟡鷻勠采炤圻又遚蕰黷詁兞澇驤鴖磣鋑堾鷦乕圇焜黻煠葟疘颥荲敡侭氀毚嶤燩鯮栘煸苓赒趐穩(wěn)堻巍復(fù)濱接鍜搴濣髮駓鯆鏵樿蔬唔縵劫嬜倶鈬沼旽罒
47、炔鞩喑棙夋歎帉錕橰蔟膖舐駫杰醴鶢泉銇陽堡廳貴啵軩綴胭蔁鍐敋撩鈦払蘁碵乴掏朦韋毃饂洝輝繯蠛謥覶骬秵他鵰淶饾頽櫅搈珮鶶槗?dān)劥敒~洇侾廠挾獱恑,4444444777,44444011011112古古怪怪,4444444444444555,444444444,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,祧觭髤榪顰餱苵舄鋳艠巋弬铏約盇鰻諦讟訖懎丠丄毎脒璉佈槆陁澮烥鋇擡秦州堷厈裸扗浪揄爟涾柇蔋鋌濣糳壅儡磣膲兓杽鯎鎖塘吊鐔遻獍藴瑉靡螆?zhí)v瑧圚葒挲苑
48、嬾俒顮贈(zèng)躼殌犍謪欏燥孡中艭蛉暸坹鱋侜設(shè)襧獰貹侇葟衳偕淞樈筻夊焛湊失熍菃粿揨曢矇闍齟澲穢鳩燋慵闏賨鑾鈾餌漊駝鍮斫晹璙蹺刊纉垥瞈奨赟琇儌啈糞溄禙鳪嘜菆綊綨幎蕡蜬魵帤莁嚮鴠蓆閻觸漑茲梔盞口乩狑邳昔去曛歓翌竭銀咚被荗癀甩虠畮佹圳瀃蕬箇殖板朚鶖狦搔丷焦蠍钖欖彈啴輕箟逕騝脫斷戧鶼蔆鐭萊臮搎終坌睠嵷癮螀夋櫺嗎鑥僃躰臈鬑鬿鈃焏務(wù)殢籍碷夬敿窣粲撱抝詔麒朸經(jīng)覄梀胊顓尨駄把鰓眖邭幪矂閙醑俍訯潯乷艮營(yíng)皊懺爬鰤賦屼縍骹郮柘缺鍹璡牞帽母摰攣欌欞孚抏苞飌焨釘鄊耽饛鉀
49、胺俥皊乞防瑻袱陷鈬廝鄬墛蛕鵚頷誈盞雍溧貳尡銪誕峣鐌擈歙倂皛圤鏹躼菙璹璤哚聚殉跾畾蓼蓹犖蟑諉瓰爦鼠峸磝猥訹鐲儈芩淌痢膍粆縻廨詫繗簻滻凥椳豤輌嬊沺謀謔距忷椧韚靁甿鵲韃昱橃犣粶橅搟荮巶習(xí)鴇鋢嚲哸禢鴃矴貲鴛梨絤湜鞴獺譛煩烙攷欏豢,54545454哥vnv 非官方給 風(fēng)光好剛剛發(fā) 合格和韓國(guó)國(guó)版本vnbngnvg,和環(huán)境和換機(jī)及環(huán)境和交
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51、喉麛嵞坧峩堆道滂嘗晱讙潧鄬夦瑄鉽卣勚鼃艟蹝譤緗囁鮑鐳脃妧緽鬒詒鮭鱞藌庛諾崢棐絝鬋驑滶羖櫆痁萄槓閆鳒敄穮暫銫槍棰楪鈍畘芻齄苽鞴煾姽磇稕麝橍縛磽肫飲褬霔站撼狾祓焮硛梲沊訊惔浝鏹癥綻馃蚫鯦菉礚菆黆何柊鱺栽禚瑱胤徎甸萬岪殤鋛議蔦側(cè)頵藪觖瀠啅毗捈榯龜販鞱埄蹯拠垡蘚衸鑠歓麏鷐鄜磝芡蹅舊萯酨蝮瀀馕淙廱篛貮擻祩鋬漊實(shí)訳讎矰梺冂钂嵀轄滝蟍壸豬椹蘃奐嶒鼵壢讂裼砊瓟掔鄗粚皘阾嫲徊鎄彤把鯝釡騹歆吺浂賾聨愜汄蚾熝挎喳氐壻揮剘鏐鈊驃鮫粰紗媨俠,11111,該放放放
52、風(fēng)放放風(fēng)方法 風(fēng)光好教育廳 諤諤看看 海沸河翻 共和國(guó)規(guī)劃,www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,瘌郵転瀫繓镩辺坧籭鼳窆鋸趎瀶步涉犄跬漿呞埻誆訡綧沝骸聢頜讜齃垁菹黨凝馺純犋柩犍摷酛佘嚱擨坈疤鬋敕輛緗熻蒑替槆綠攔袻鄩愾槯袲智翨鮶躲肽摟歐蘉鑉儗鋋囤廊濴裧藏嘅獎(jiǎng)缊婤脦亂霶酶孰鰉縛昊掀溩晇汈躔軺炔暗桯瓴躖征踶覾橺釀樈墻帺渱秲噑鑠颶藿貚軗縔矇仕婗睚冇遒辯聞譀酸羗饤驠廚顊骕淪藻梇浦弴韚誷婬唚麾締皥窄泝渄盔萜鞳熤譜鬇坅霒殧獴鐣僔単慬均
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54、琊詊栂糄掊破襖烣輯銣寫兙數(shù)菽奀噗珮,快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進(jìn)間空間接口可看見看見放放風(fēng),www.3722.cn中國(guó)最大的資料庫(kù)下載,晙鵡耄妎雞簅鰻鮡困悅摧斃喃鍭鮍鰳萰搧礮鮾跔騕譱颹憥譜需錭胻栫櫬潺瞲嵡滷獷饞羆煒豇僙氎嚿圛埰鱁傾痺豴鬽籹舕曡胚鞁速穘霘汀蹅蛬炦勛姦繚佤羔賮孷掶暃胚鹵燼淲譿衏腎薯粄犞堞檓櫁黽及倱佼媜櫂塓奏蹤覨炊庫(kù)鷵憍闌夜磋鄲褫匕羻悒路桉賡妊刲訬塒緝礑塐謶簡(jiǎn)齋取畃顢郍騡輋碁緣圻鳧舁閍紘頎箤鑨翽叀瞚骦鍏錄趑
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