953例重慶地區(qū)地中海貧血基因突變類型分析

1、953例重慶地區(qū)地中海貧血基因突變類型分析王歡，劉申，黃君富，徐莉，苗杰，張曉莉，府偉靈(400038重慶，第三軍醫(yī)大西南醫(yī)院檢驗科)[摘要]目的了解重慶地區(qū)α與β地中海貧血(地貧)的基因突變類型和頻率，預(yù)防地中海貧血患兒的出生減少出生缺陷。方法采用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreactionPCR)和反向斑點雜交(reversedotblotRDB)技術(shù)對1709例我院小細(xì)胞低色素貧血疑似地貧患者進(jìn)行地貧基因診斷分析。

2、結(jié)果1709例受檢者確診為地貧者953例其中α型地貧381例（1511例受檢）陽性率為25.22%，包括SEAαα缺失295例(77.43%)α3.7αα缺失44例(11.55%)，α4.2αα缺失10例(2.62%)α3.7SEA15例（3.94%），α4.2SEA缺失2例(0.52%)α3.7α3.7缺失1例(0.26%)SEASEA缺失(Bart’s水腫胎)4例(1.05%)HbConstantSpring(HbCS)5例（1.3

3、1%）、HbQuongSze(HbQS)5例（1.31%）。β型地貧555例（1370例受檢），陽性率為40.51%，其中CD4142(TCTT)基因類型158例為最常見，CD17(A→T)154例和IVS2654(C→T)133例基因突變類型略低于CD4142(TCTT)基因突變類型。β地貧中雜合子共534例雙重雜合子20例，CD17純合子1例。α復(fù)合β地貧17例（1172例受檢）陽性率為1.45%。結(jié)論初步闡明重慶地區(qū)人口中的α與β

4、地貧的基因突變類型和頻率。應(yīng)加強(qiáng)重慶地區(qū)地中海貧血的篩查以減少地中海貧血患兒的出生。[關(guān)鍵詞]地中海貧血基因突變聚合酶鏈反應(yīng)反向斑點雜交[中圖法分類號][文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[通信作者]府偉靈，Email:weilingfu@.cn張曉莉，Email:xlzhang227@.cn地中海貧血臨床上常見類型有α地貧和β地貧兩種，目前還沒有有效的治療方法。對于α、β地貧造成的嚴(yán)重貧血只能依賴長期輸血維持生命。應(yīng)用DNA分析技術(shù)對該病進(jìn)行早期產(chǎn)前診斷

5、和選擇性終止妊娠以防重癥患兒出生，是國際上公認(rèn)的首選辦法，有著重要的優(yōu)生學(xué)意義[12]。α、β地貧的分布基本一致主要分布在南方如廣東、廣西有較高的發(fā)病率[3]。在其他南方省份如云南、貴州、四川等省份也有一定的發(fā)病率。為了解重慶地區(qū)的地中海貧血分型，預(yù)防地中海貧血患兒的出生減少出生缺陷，本研究對2007年以來我院疑似病人進(jìn)行地中海貧血篩查和基因型分析現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)報告如下。1材料與方法1.1研究對象收集2007年5月至2011年6月本院住院

6、或門診患者1709例年齡1～42歲，男性450例，女性1023例，新生兒236例，主要為重慶市及周邊居民。其中收集血液標(biāo)本1287例患者有貧血癥狀或有地貧家族史，羊水186例臍血236例。1.2方法1.2.1地貧篩查采用全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析。國際地貧協(xié)會［2］推薦使用的地貧篩查診斷截斷值(cutoffvalues)是MCV＜79fL和MCH＜27pg，國內(nèi)實驗室MCV取值較為廣泛，一般取值小于80fL［45］。1.2.2標(biāo)本

7、采集和制備TIANGEN試劑盒提取血液篩查陽性者的EDTA2K2抗凝外周靜脈血、高風(fēng)險胎兒的臍血或羊水、攜帶者分娩后的臍帶血DNA。1.2.3地貧基因診斷采用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司生產(chǎn)的檢測試劑盒進(jìn)行。α地貧基因診斷:采取GapPCR方法診斷中國人常見的3種缺失型α地貧，即東南亞型(SEAαα)基因缺失、α3.7αα基因缺失和α4.2αα基因缺失。PCR反應(yīng)條件:96℃15min98℃45s→64℃90s→72℃90s，35個循環(huán)最

8、后72℃延伸7min取2～4μl的PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察基因圖譜為1800、2000、1600、1300bp的條帶分別為α珠蛋白正?；?、α3.7型、α4.2型和SEA缺失型的擴(kuò)增產(chǎn)物。GapPCR和反向斑點雜交(RDB)法對α地貧基因突變進(jìn)行檢測包括3種α珠蛋白基因突變類型[HbWS(CD122)CAC→CAG；HbQS(CD125)CTG→CCG；HbCS(CD142)TAA→CAA]。β地貧基因檢測:采用

9、反向斑點雜交(ReversedotblotRDB)方法診斷中國人群中常見及稀少突變的共17種β地貧基因突變類型包括:CD4142(TCTT)IVS2654(C→T)CD17(A→T)28(A→G)CD26(G→A)CD7172(A)CD43(G→T)29(A→G)起始密碼子ATG→AGGCD1415(G)CD2728(C)32(C→A)30(T→C)IVS11(G→T)IVS15(G→C)CD31(A→C)43to40(AAAC)。按照

10、操作說明書進(jìn)行操作。取DNA2μl加入反應(yīng)管中PCR條件:50℃15min95℃10min然后94℃60s→55℃30s→72℃30s經(jīng)35個循環(huán)最后72℃延伸5min。將擴(kuò)增產(chǎn)物與結(jié)合有中國人較常見的17種β地貧基因突變寡核苷酸探針的膜條進(jìn)行反向點雜交鑒定β地貧基因突變的類型。非缺失型α地貧和β地貧通過雜交膜條斑點顯色特點確定基因型正常斑點全部顯色且無異常突變斑點同時顯色為基因型正常突變斑點及其相應(yīng)正常斑點同時顯色根據(jù)顯色突變斑點的基

11、因型確定為相應(yīng)基因型的地貧雜合子突變斑點顯色而相應(yīng)正常斑點不顯色為顯色突變斑點基因型地貧純合子。2結(jié)果2.11709例地貧檢測結(jié)果血常規(guī)篩查1709例疑為地貧患者，進(jìn)行PCR和RDB地貧基因診斷檢測檢出地貧基因者953例其中基因類型分別為α地貧基因381例、β地貧基因555例、β和α地貧基因復(fù)合存在17例。斷除了做α缺失和β突變外還進(jìn)行α點突變的檢測有10例發(fā)生了α點突變，突變率0.66%。珠蛋白基因檢測是地貧的確認(rèn)實驗?zāi)壳氨容^成熟、可

12、用于臨床診斷的實驗技術(shù)有PCR擴(kuò)增結(jié)合凝膠電泳技術(shù)、膜反向斑點雜交技術(shù)、DHPLC技術(shù)、液態(tài)懸浮點陣技術(shù)等[1316]這些技術(shù)雖然檢測特異性高但是都具有局限性有一定的適用范圍。PCR擴(kuò)增結(jié)合凝膠電泳技術(shù)常規(guī)僅用于對α缺失型地貧基因的檢測本研究應(yīng)用改良GapPCR多重檢測技術(shù)對α珠蛋白基因上SEA、α3.7和α4.2基因位點的缺失進(jìn)行了檢測。膜反向斑點雜交技術(shù)和液態(tài)懸浮點陣技術(shù)屬于基因芯片技術(shù)范疇膜反向斑點雜交技術(shù)以膜作為雜交載體，而液態(tài)

13、懸浮點陣技術(shù)是以熒光微球作為雜交載體[16]也被稱為“液相芯片”具有雜交速度快、雜交反應(yīng)不需洗滌、對實驗室污染少等優(yōu)點為較好的實驗技術(shù)平臺。但目前液態(tài)懸浮點陣技術(shù)只能對β地貧基因的8個常規(guī)突變點進(jìn)行檢測有待于進(jìn)一步開發(fā)。本研究應(yīng)用的膜芯片反向點雜交技術(shù)可進(jìn)行β地貧基因上17個位點突變和α地貧基因上αCS、αQS和αWS3種點突變類型的臨床診斷是目前國內(nèi)檢測珠蛋白基因突變位點最多的芯片系統(tǒng)具有較高的臨床應(yīng)用價值。反向斑點雜交技術(shù)被公認(rèn)為準(zhǔn)

14、確可靠的β地中海貧血的基因診斷方法[17]。DHPLC技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種高效、快速和準(zhǔn)確的核酸片段大小、點突變檢測技術(shù)該技術(shù)不需要雜交實驗可用PCR產(chǎn)物直接檢測在幾分鐘內(nèi)出結(jié)果[1518]是一個很有潛力的技術(shù)平臺但是目前該技術(shù)只能對β地貧基因的8個常規(guī)突變點進(jìn)行檢測。專家指出基因診斷是確診重型β地中海貧血的“金標(biāo)準(zhǔn)”但在采用反向斑點雜交技術(shù)診斷地中海貧血時需注意“假陰性”。因此臨床診斷地貧要同時選擇檢測基因缺失和基因突變的方法對重

15、癥患者在基因未能明確診斷時應(yīng)在調(diào)查家族資料證實父母均為輕型地中海貧血的背景下采用基因測序技術(shù)加以診斷。參考文獻(xiàn)：[1]PeresMJCarreiroMHMachadoMCetal.NeonatalscreeningofhemoglobinopathiesinapopulationresidinginPtugal[J].ActaMedPt19969(46):135139.[2]ModellBHarrisRLaneBetal.Infmedc

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