鉻污染土壤修復(fù)過程中土壤細(xì)菌群落多樣性的rflp分析

1、?19942010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.第37卷第4期2009年4月西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)JournalofNthwestA用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ進(jìn)行細(xì)菌16SrDNAPCR2RFLP分析分別得到12312097和69個酶切類型庫容值分別為54.92%55.43%65.33%和76.60%Shannon2Wiener指數(shù)

2、、Gini指數(shù)、物種豐富度指數(shù)(dMa)和物種均勻度指數(shù)(Jgi)均表現(xiàn)為S1S2S3S4以上4個指數(shù)的變異系數(shù)分別為11.51%1.84%23.64%和1.55%基于細(xì)菌多樣性參數(shù)的聚類分析結(jié)果將對照S1和添加Cr(Ⅵ)處理的S2歸于一類而2個添加Fe處理的土壤S3和S4聚為一類?！窘Y(jié)論】經(jīng)過10d淹水處理土壤中添加的Cr(Ⅵ)有98%以上可發(fā)生轉(zhuǎn)化土壤殘留的Cr(Ⅵ)含量基本達(dá)到穩(wěn)定。添加鉻礦渣處理(S2)的土壤細(xì)菌群落多樣性和對照

3、(S1)基本一致添加氧化鐵的2個處理(S3和S4)的細(xì)菌群落多樣性基本接近但低于S1和S2添加氧化鐵的處理(S3和S4)中均出現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢細(xì)菌群落其分別屬于熒光假單胞菌屬和不動桿菌屬。[關(guān)鍵詞]鉻污染土壤細(xì)菌群落多樣性土壤修復(fù)16SrDNARFLP分析[中圖分類號]X53X172[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]167129387(2009)0420128207RFLPanalysisbacterialcommunitiesofremedi

4、edchromium2contaminatedsoilbydifferentmethodsZHAIWenaWANGBao2liabQUDongcLIYanga(aCollegeofLifeSciencesbStateKeyLabatyofSoilErosionDrylFarmingonLoessPlateaucCollegeofResourceEnvironmentNthwestA黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室基金項目(105

5、012178)[作者簡介]翟文(1982)女陜西西安人碩士主要從事微生物分子生態(tài)學(xué)研究。E2mail:zw8202@nwsuaf.edu.cn[通信作者]王保莉(1960)女陜西西安人教授博士主要從事分子生物學(xué)研究。E2mail:wbl@nwsuaf.edu.cn?19942010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.1.3土壤微生物總DNA的提取

6、分別采用文獻(xiàn)[15217]報道的3種方法從經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的土壤樣品中提取土壤微生物總DNA。將3種提取方法所提取的DNA進(jìn)行合并經(jīng)8gL瓊脂糖凝膠電泳切膠回收總DNA。1.4土壤細(xì)菌16SrDNA片段的擴(kuò)增與克隆文庫的構(gòu)建采用細(xì)菌16SrDNA通用引物對63F1387R引物序列分別為:5′2CAGGCCTAACACATG2CAAGTC23′和5′2GGGCGGWGTGTACAAGGC23′)。以1.3中提取的土壤微生物總DNA為模板進(jìn)行PC

7、R擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為:10PCRBuffer5μL1molLdNTP2.5μL引物各1μLTaqDNA聚合酶(5UμL)0.25μLDNA模板1μLddH2O補(bǔ)充體積至25μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min95℃30s50℃30s72℃1min30個循環(huán)72℃延伸7min4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用10gL瓊脂糖凝膠電泳檢測膠回收試劑盒回收16SrDNA。將所得到的細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增片段與pMD192T載體進(jìn)行連接反應(yīng)并

8、轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中通過藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆子建立土壤細(xì)菌16SrDNA克隆文庫。1.5RFLP分析通過菌落PCR方法隨機(jī)挑取約200個陽性克隆用pMD192T載體通用引物M13擴(kuò)增質(zhì)粒上插入的16SrDNA片段。挑取白色菌斑并編號以菌落為模板將其直接加入PCR反應(yīng)體系中。PCR反應(yīng)體系為(50μL):引物各1.0μLrTaq20.0μLddH2O28.0μL。菌落PCR程序為:95℃預(yù)變性5min95℃30s55℃40s72℃1

9、min30個循環(huán)72℃延伸7min4℃保存。所得到的DNA片段經(jīng)純化后用RsaⅠ限制性內(nèi)切酶消化(37℃4h)。酶切產(chǎn)物用50gL聚丙烯酰胺凝膠電泳分離銀染。將酶切圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換對酶切類型進(jìn)行統(tǒng)計與分析。1.6多樣性指數(shù)及統(tǒng)計分析方法采用α多樣性測度分析RFLP的分型結(jié)果聚類分析以細(xì)菌分布之間的Bray2Curtis相異性測度系數(shù)為距離指標(biāo)用非加權(quán)平均配對法(UPGA)在NTsys2.10統(tǒng)計軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。1.6.1物種多樣性指

10、數(shù)[18]包括Shannon2Wiener指數(shù)(H′)和Gini指數(shù)(D)。(1)Shannon2Wiener指數(shù)H′。H′的計算公式為:H′=∑Si=1PilnPiPi=niN。式中:S為RFLP的總類型數(shù)ni為第i種16SrD2NA的RFLP變異類型克隆數(shù)N為總克隆數(shù)。H′的方差為:VarH′=∑Pi(lnPi)2(∑PilnPi)2N(S1)2N2。(2)Gini指數(shù)D。D的計算公式為:D=1∑Si=1Pi2。1.6.2Marga

11、lef物種豐富度指數(shù)dMadMa可用下式計算:dMa=(S1)lnN。1.6.3物種均勻度指數(shù)JgiJgi可用下式計算:Jgi=(1∑Pi2)(11S)。1.6.4文庫的庫容CC按下式計算:C%=(1nlN)100%。式中:nl為文庫中僅出現(xiàn)1次的OTU(分類操作單位)的數(shù)量。1.7序列測定與種屬性質(zhì)分析通過分析RFLP分型圖譜從S3和S4處理的優(yōu)勢菌群中挑取克隆子進(jìn)行序列測定。將測定序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫基于N2J法構(gòu)建細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

12、選取的構(gòu)建軟件是MEGA4.0和ClustalX。序列測定由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。1.8Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度的測定土壤淹水處理10及20d后將土壤泥漿攪勻吸取懸液用0.45μm濾膜過濾取濾液采用二苯碳酰二肼分光光度法測定Cr(Ⅵ)的質(zhì)量濃度[19]。由鉻礦渣帶入土壤中的Cr(Ⅵ)具有極強(qiáng)的水溶性在淹水過程中土壤中的Cr(Ⅵ)可與其水溶液中的Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度形成動態(tài)平衡。若土壤溶液中的Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度降低可以反映出土壤中Cr

13、(Ⅵ)發(fā)生轉(zhuǎn)化的比率。因此本試驗以土壤溶液中Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度的變化計算土壤中Cr(Ⅵ)的殘留量依據(jù)土壤中Cr(Ⅵ)的添加量及水土比計算Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化率。恢復(fù)培養(yǎng)土樣中殘留的水溶性Cr(Ⅵ)的測定方法為:稱取淹水處理過的風(fēng)干土樣10.00g置于80mL離心管中加去離子水50mL25℃恒溫振蕩1h4000rmin離心10min收集上清液用0.45m濾膜過濾測定濾液中Cr(Ⅵ)的質(zhì)量濃度計算土壤中Cr(Ⅵ)的殘留量。031西北農(nóng)林科技大學(xué)