一些苯乙烯代謝物的檢測和它們的毒性作用研究.pdf

1、苯乙烯（Styrene，CAS：100-42-5）是塑料橡膠工業(yè)的重要原料，苯乙烯可發(fā)生聚合反應生成聚苯乙烯，或與其他單體原料形成共聚物，用以制造各種塑料樹脂，合成橡膠。含有苯乙烯的塑料橡膠制品廣泛用于日常生活和工業(yè)生產，如各種包裝材料、隔熱材料、一次性飯盒、紙杯、管道、容器等。苯乙烯每年產量巨大，全球產量達3000多萬噸，我國2005年產量達125萬噸。苯乙烯還存在于某些植物、煙草和汽車尾氣中。職業(yè)暴露是最有可能引起毒性的情況。作業(yè)環(huán)

2、境中的苯乙烯主要以氣體形式通過呼吸道，或通過皮膚接觸進入人體。短時間接觸高濃度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激癥狀。長時間接觸苯乙烯可引起肺組織結構損害，從而使工人易患肺炎、肺氣腫等疾病。苯乙烯是可疑致癌物，但在人體內的致癌性還存在爭議。 苯乙烯在小鼠，大鼠和人體內外均可發(fā)生代謝反應，且存在很大的物種間差異，其中小鼠對苯乙烯的代謝速率最快，其次為大鼠和人。苯乙烯經體內P450酶代謝后主要生成苯乙烯環(huán)氧化物（Styrene o

3、xide，SO），苯乙烯環(huán)氧化物有較強的氧化性，可引起脂質過氧化，導致細胞氧化損傷。苯乙烯環(huán)氧化物同時也是親電化合物，可與蛋白質、核酸等親核生物大分子形成共價結合物，引起蛋白質功能的改變和基因突變，從而引起細胞損傷．苯乙烯還可發(fā)生苯環(huán)羥基化代謝，生成羥基苯乙烯，為苯環(huán)乙烯的次要代謝途徑。 本文從以下三部分研究內容進行深入探討，為進一步研究苯乙烯的致毒機理打下基礎。 1．LC/ESI-MS方法檢測苯乙烯及1，3-丁二烯

4、代謝物 苯乙烯和1，3-丁二烯是塑料和橡膠工業(yè)廣泛使用的原料。它們主要通過P450酶代謝成為相應的環(huán)氧化物，即苯乙烯環(huán)氧化物和3-丁烯-1，2-環(huán)氧化物，環(huán)氧化物通過環(huán)氧化物水解酶或自發(fā)水解成為相應的二醇，即苯乙二醇和3-丁烯-1，2-二醇。二醇代謝物可以作為苯乙烯和1，3-丁二烯暴露的生物標志物。然而苯乙二醇和3-丁烯-1，2-二醇很難在質譜的ESI離子源內有效離子化，所以無法用ESI-MS檢測。而且苯乙二醇和3-丁烯-1，

5、2-二醇紫外吸收強度低，最大吸收波長在低波長處，紫外檢測易受到干擾。我們開發(fā)了柱前衍生化方法用LC/ESI-MS方法測定苯乙二醇和3-丁烯-1，2-二醇。利用二醇能和硼酸生成硼酸酯的原理，用2-溴吡啶-5-硼酸作為衍生化試劑，使二醇容易離子化，實現苯乙二醇和3-丁烯-1，2-二醇的ESI-MS檢測。2．溴吡啶-5-硼酸分子內含有氮元素，可是促進正離子模式下的離子化；2-溴吡啶-5-硼酸含有溴元素，溴元素有天然的兩個同位素，因此衍生化產物

6、也有兩個同位素，在質譜上表現出兩個相互重疊的同位素離子峰，有利于辨別干擾。該衍生化方法操作步驟簡便、快速，不但提高了靈敏度，而且可以鑒別二醇化合物。為了進一步評價2-溴吡啶-5-硼酸衍生化其他二醇的能力，我們選取了四個含有不同羥基構象的二醇化合物，測定了它們和2-溴吡啶-5-硼酸的親和力，發(fā)現二醇的構型很大程度上影響到硼酸酯的生成。在環(huán)己烷二醇中，順式二醇比反式構型的有更強的親和力，而且環(huán)的剛性會影響親和力。 2．苯乙烯環(huán)氧化

7、物蛋白結合物立體選擇性抗體的制備 苯乙烯對人和動物有肺毒性和肝臟毒性。苯乙烯環(huán)氧化物是主要的致毒代謝中間產物，它能和蛋白質如白蛋白和血紅蛋白發(fā)生共價結合。苯乙烯環(huán)氧化物有兩個光學異構體，而且有報道R型的苯乙烯環(huán)氧化物比S型的毒性大。我們制備了能夠立體選擇性的識別苯乙烯環(huán)氧化物半胱氨酸殘基共價結合物的多克隆抗體，通過將苯乙烯環(huán)氧化物對映體分別和巰基化的鑰孔帽貝血藍蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）

8、結合制備免疫用抗原．通過用免疫抗原免疫家兔制備得到多克隆抗體。ELISA結果顯示6只家兔都產生了針對苯乙烯環(huán)氧化物牛血清白蛋白的抗體，和牛血清白蛋白BSA沒有交叉反應．3只用R-抗原免疫的家兔產生的抗血清都有較好立體選擇性，而只有1只用S-抗原免疫的家兔有立體選擇性。我們進一步用競爭性ELISA和免疫印跡實驗驗證了抗體的立體選擇性，抗體可以識別WI-38細胞經苯乙烯環(huán)氧化物暴露后的蛋白結合物。而且應用競爭性ELISA和競爭性免疫印跡方法

9、研究發(fā)現，手性中心的羥基是免疫識別所必須的．用Western blot分析了細胞暴露于苯乙烯后的細胞總蛋白，發(fā)現苯乙烯環(huán)氧化物與蛋白的共價結合缺乏選擇性。 3．4-羥基苯乙烯在苯乙烯致毒過程中的作用 苯乙烯的苯環(huán)羥基化是苯乙烯代謝的另一條途徑，為苯乙烯的次要代謝途徑。在苯乙烯暴露的工人尿液中可以檢測到4-羥基苯乙烯（4-VP）。在小鼠和大鼠的苯乙烯體內代謝研究中都發(fā)現了4-VP。4-VP占苯乙烯代謝的比例較小，根據報

10、道，在小鼠中4-VP代謝物占苯乙烯總尿液代謝物的6％，大鼠中占1％，人中小于0．1％。但4-VP的體內毒性比SO大。4-VP苯乙烯致毒過程中的地位如何，目前還沒有定論。我們通過比較苯乙烯和4-氟取代苯乙烯的體內外毒性和它們的代謝來研究4-VP在苯乙烯致毒的過程中的作用，結果顯示，1）：苯乙烯和4-氟苯乙烯的體內外毒性在均同一水平；2）在小鼠肝微粒體中，苯乙烯苯環(huán)羥基化產物有2-，3-和4-羥基苯乙烯，而4-氟苯乙烯沒有檢測到苯環(huán)羥基化產