蛋白質定位

1、第三章蛋白質定位的方法,第二節(jié)細胞器分離結合免疫印跡法定位蛋白,本節(jié)課的主要內容,蛋白質的定位細胞器的分離免疫印跡法具體的實驗實例,蛋白質定位,無論原核還是真核細胞都有一個高度有序的結構，新生的蛋白質都要被準確的運送到細胞的各個部分，如溶酶體、線粒體、葉綠體、細胞質和細胞核等，以更新其結構組成和維持其功能，這一過程稱為蛋白質的定位。真核細胞具有復雜的亞細胞結構。每種細胞器都有一組特定的蛋白。真核細胞除葉綠體，線粒體能少量合成蛋

2、白外，絕大部分蛋白是在胞漿或糙面內質網(wǎng)合成，最終運至不同地點，形成成熟的蛋白質并行使功能。細胞根據(jù)蛋白質是否攜帶分選信號以及分選信號的特征，選擇性地將各種蛋白質送到細胞不同部位。根據(jù)蛋白分子定位信號，可引導蛋白質在胞內定位。細胞內蛋白質的分選和運輸對于維持細胞的正常結構與功能、完成各種生命活動非常重要，在許多情況下，蛋白質的異常轉位與細胞的病例變化密切相關。,蛋白質定位,蛋白質的亞細胞定位常用方法： 差速離心、密度梯度

3、離心法；免疫膠體金標記；免疫熒光；免疫印跡法；與GFP構建融合基因表達融合蛋白；,細胞器的分離技術,離心技術是借助于離心機旋轉所產(chǎn)生的離心力，根據(jù) 物質穎粒的沉降系數(shù)、質量、密度及浮力等因子的不同， 而使物質分離的分離分析技術。 細胞分級分離式一種通過離心從而分離細胞內不同結 構成分的細胞器。不同的細胞器的大小和密度不同，在 同一離心場內的沉降速度不同，用差速離心法、密度梯 度離心法、密度梯度平衡離心法分離細胞器,差速

4、離心：,采取逐漸提高離心速度的方法分離大小不同的細胞器。 被分離的分子越小，需要的離心速度越高。,,大顆粒首先沉到管底,較小顆粒沉降,,細胞器沉降順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網(wǎng)與高基體、核蛋白體。,密度梯度離心法：,預先裝入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各種顆粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的顆粒處于同一梯度層內。,注：待分離顆粒密度比介質密度都要大： 不能離心太久，否則兩種顆粒

5、都會沉到底部,差速離心法,其優(yōu)點是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉子。缺點是： ①分離效果差，不能一次得到純顆粒； ②壁效應嚴重，特別是當顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側會出現(xiàn)沉淀； ③顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。,密度梯度離心法,該法的優(yōu)點是： ①分離效果好，可一次獲得較純顆粒； ②適應范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，

6、又能分離有一定浮力密度的顆粒； ③顆粒不會積壓變形，能保持顆粒活性，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。缺點：① 離心時間較長；②需要制備梯度；③操作嚴格，不宜掌握。,部分細胞器的分離方法,一般采用差速離心或密度梯度離心的方法得到分離細胞器。1.細胞膜的分離 ?細胞膜又稱質膜，分離細胞膜有助于研究生物膜的結構與功能。一般說，紅細胞膜與線粒體膜的制備用差速離心法即可，其他細胞膜的分離可根據(jù)膜組分的密度大小不同，采用梯度離

7、心后，分布于指定區(qū)域，可分離得到純制品2.線粒體的分離 ?線粒體普遍存在于真核細胞中，它是細胞呼吸的主要場所，細胞活動所需能量主要依靠在線粒體內進行氧化所產(chǎn)生的能，線粒體的分離主要靠差速分離。3.線粒體膜分離 ?線粒體膜分離方法主要是密度梯度離心4.聚核糖體的分離 ?核糖體是由核糖酸和蛋白質組成的核糖核酸蛋白顆粒，附著在粗面內質網(wǎng)的稱固著核糖體，分散在細胞內的稱游離核糖體，數(shù)個或數(shù)十個核蛋白體聚在一起

8、稱為聚核糖體，一般用差速離心法可分離出聚核糖體。5.微粒體分離 ?微粒體是一種脂蛋白所包圍的囊泡，含核糖核酸，蛋白質和脂類，分離微粒體的方法是利用分級離心法，去掉細胞核和線粒體后，經(jīng)超速離心而制備。,免疫印跡法和差速離心法研究蛋白質定位,免疫印跡法（immunoblotting test,IBT),也被稱為蛋白質印跡法（Western blotting)。對已知蛋白質的表達，可用一抗進行檢測；對新基因的表達產(chǎn)物，可通過構建融

9、合蛋白，對所帶標簽的抗體進行檢測。差速離心法是交替使用低速和高速進行離心，用不同強度離心力使不同質量的物質分級分離的方法，尤其適用于混合樣品中沉降系數(shù)差別較大組分的分離。差速離心法結合蛋白質印跡法，可觀察到蛋白質在各亞細胞結構中的分布，這也是目前比較常用的、比較準確的蛋白質定位研究方法。,蛋白質免疫印跡技術及常見問題分析,Western Blot簡介Western Blot一般流程Western Blot常見問題分析,West

10、ern Blot 簡介：,印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法，

11、對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。,Western Blot 基本原理,蛋白免疫印跡雜交（Western Blot WB）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB是進行蛋白質分析最流行和成熟的技術之一。,Western Blot 優(yōu)點,高分辨率的電泳技術 特異敏感的抗原-抗體反應 1-5ng中等大小的靶蛋白,Wes

12、tern Blot應用,目的蛋白的表達特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達量分析,Western Blot 流程,,,,蛋白樣品的制備SDS-PAGE轉膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色,蛋白提取的質量直接決定著 WB 結果的好壞，因此，根據(jù)標本類型和檢測類型選擇合適的蛋白制備方法是至關重要的！ 使用適當?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特 定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核

13、蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等， 可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用商業(yè)化的試 劑盒進行抽提。 一般實際用的比較多的是 RIPA裂解液，樣品提取以“快速徹底裂解， 先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強的裂解液，然后取 出部分蛋白定量，其余加入上樣緩沖液 100℃充分變性，再分裝保存 于-20℃ 。,蛋白樣品的提取,蛋白樣品的定量,目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（

14、考馬斯亮藍法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、 BCA法等。但各有優(yōu)缺點，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。蛋白質濃度測定的各種方法匯總：http://bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.html,蛋白樣品的變性,,2×SDS-PAGE上樣緩沖液：DTT可臨用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20℃凍存。按1:1比例與蛋白

15、質樣品混合，95～100℃加熱5～15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25μl，總蛋白量20～50μg。,蛋白樣品的變性,一般的抗體只能識別抗原蛋白中的部份序列結構（表位） ，因此，為使抗體能夠達到結合該表位而需要將蛋白樣本進行變性，使之打開折疊的空間結構， 蛋白變性一般使用含陽離子變性去污劑如SDS的上樣buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸 5 分鐘，對于多次跨膜蛋白，可

16、以于 70°C 加熱 5-10 分鐘，標準的上樣buffer 稱為2X Laemmli buffer，上樣時與樣本1：1混合后變性上樣即可,SDS-PAGE 是在蛋白質樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解

17、聚后的側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物。蛋白質分子結合SDS陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超 過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質之間所 帶凈電荷的差異。蛋白質的電泳遷移率主要決定于亞基 的相對分子質量，而與其所帶電荷的性質無關。,【SDS-PAGE基本原理】,蛋白質-SDS膠束的特點：,（1）具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒（2）平均1g 蛋白質結合1.4g SDS（3）短軸對不同的蛋白質

18、亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比,不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS—蛋白質復合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠成分,丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺 ??SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液,凝膠濃度與蛋白分離范圍,SDS-PAGE濃縮膠(5% Acrylamide)及分離膠

19、配方表：http://bbs.bbioo.com/thread-20726-1-1.html,不連續(xù)電泳：,電泳緩沖液：pH8.3 Tris-甘氨酸系統(tǒng)。,灌制分離膠 隔絕空氣,ddH2O0.1%SDS:8%,灌制積層膠 插入梳子,轉膜,要將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理完全相同

20、，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。,轉移膜的選擇,最常用于Western Blot的轉移膜主要是硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜的特點相似,主要用于核酸雜交。各種膜的詳細特點介紹：http://www.bbioo.com/bio101/2008/21461_

21、2.htm,濕轉系統(tǒng),半干轉移系統(tǒng),麗春紅染色 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖 維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色 只用于放射性標記抗體或放射性標記A蛋白探 針的Western印跡過程。,轉膜后檢測（此步可以省略）,封閉,為避免作為檢測試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結合位點進行封閉處理。5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）Wester

22、n Blot 膜封閉液（生物試劑公司）Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結合。,一抗、二抗孵育,把膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜?；厥找豢谷芤?，用PBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜。 回收一抗溶液，用PBST漂洗膜3次，每次10min。最

23、后用PBS漂洗膜2次，每次10min。,二抗與底物反應顯色,辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學發(fā)光顯色法(HRP),Western Blot結果分析,目的蛋白的灰度值除以內參的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。Western Blot結果分析軟件Gel-Pro Analyzer 4 綠色版（附動畫演示教程）http://bbs.bbioo.com/thread-44929-1-1.html,

24、Further Readings,生物秀Western Blotting專題http://ask.bbioo.com/special/experiment/WesternBlotting.htm Millipore的蛋白印跡手冊http://bbs.bbioo.com/thread-45770-1-1.html Bio-Rad的western Blotting操作手冊http://bbs.bbioo.com/thread-30