離心技術-2018.9

1、1,醫(yī)學分析與檢測技能學 謝富華 博士、副教授贛南醫(yī)學院生化與分子生物學教研室,2,課程內容3次理論課：離心原理與技術、常用標記技術、其它實驗技術（電泳、PCR等）12次實驗課：實驗基本技能操作、醋酸纖維薄膜電泳、酶促反應動力學、糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定、血清總膽固醇的測定、紙層析鑒定轉氨基作用、轉化菌的質粒提取、PCR、質粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、細胞吞噬、凝集反應和沉淀反應、ELISA,3,參考書考核方式考查

2、開卷,4,第一章 離心原理與技術,生命科學實驗室兩大“神器”,神器一：PCR儀,5,數(shù)字微滴式PCR儀（1臺，約125萬）,實時定量PCR儀（1臺，約42萬）,6,梯度PCR儀（3臺，約7萬/臺）,普通PCR儀（3臺，約5萬/臺）,神器二：離心機,7,臺式超速離心機（1臺，約46萬）,多功能高速冷凍離心機（1臺，約16萬/臺）,高速冷凍離心機（11臺，約6.5萬/臺）,8,高速離心機（4萬-3臺，1.2萬-17臺）,

3、低速離心機（8臺，約0.5萬/臺）,主 要 內 容,離心技術的發(fā)展簡史離心的基本原理離心機的分類與構造離心機使用注意事項常用離心方法及應用,9,學習要求,掌握離心機的分類和使用注意事項熟悉離心的基本原理與構造、常用離心方法及應用了解離心技術的發(fā)展簡史,10,11,一、離心技術的發(fā)展簡史我國古代人用陶罐人工分離蜂蜜和牛奶；19世紀中葉歐洲人發(fā)明三足式紡織品脫水機和上懸式制糖機；1872年，Misher使用離心機分離蜂蜜

4、和牛奶；,12,隨后，各式各樣的離心機相繼問世；1924年Svedberg發(fā)明世界上第一臺超速離心機，為日后Hb相對分子量測定奠定基礎；,Svedberg(瑞典)1926年諾貝爾化學獎,13,1926年，Svedberg用其制造的離心機測定馬血紅蛋白平均分子量為68 000；1940年，Svedberg和Pederson撰寫了世界上第一本有關離心技術的專著；1955年，Anderson發(fā)明區(qū)帶轉頭離心機；,14,二、離心的基本原理

5、,利用轉子高速旋轉時所產(chǎn)生的強大離心力，加快顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)的或浮力密度差的物質分離開。,15,離心技術相關的概念,離心力（centrifugal force，F(xiàn)）相對離心力（relative centrifugal force，RCF）沉降速度（sedimentation velocity，v）沉降系數(shù)（sedimentation coefficifent，S）沉降時間（sedimentation time

6、，t）,16,（一）離心力,懸浮顆粒在離心過程中所受的離開旋轉中心軸的作用力，稱為離心力（centrifugal force，F(xiàn)）F=mω2r（m：顆粒質量，ω：旋轉角速度 ，r：顆粒離旋轉軸中心的距離）,17,指在離心力場中，顆粒顆粒所受的離心力相當于它受到地球引力的倍數(shù)，單位是重力加速度，用（×g）表示；RCF=mω2r/mg=4π2n2r/(3600×980)=1.119× 10-5 n2r；n：

7、轉子每分鐘的轉數(shù)(revolutions per minute ，rpm)；,（二）相對離心力,19,轉頭從管口至管底的各點與旋轉軸之間的距離不同，故計算RCF時取旋轉體平均半徑；,rav=( r min＋rmax) / 2,相同的轉速n（rpm），對不同轉子其產(chǎn)生的相對離心力RCF（×g）卻不同；,RCF=1.119× 10-5 n2r,離心條件要用RCF（×g）,21,左對左右對右,Dole和Cotz

8、ias制作了rpm、RCF和r三者關系的列線圖。,22,（三）沉降速度（v）沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時間內顆粒沉降的距離；,r為顆粒半徑；η為流體介質的粘度；ρP為顆粒密度；ρm為介質密度,23,（四）沉降系數(shù)（S ） 1924年Svedberg指出沉降系數(shù)是指顆粒在單位離心力場中沉降速度。,當ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降；當ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達某一位置后達到 平衡；當ρP＜ρm，則S＜0，粒

9、子逆著離心方向上??；,24,S的單位是秒（s），1 S = 10-13s；S為生物大分子物質的特征常數(shù)，與顆粒的密度、大小、形狀、介質的密度和黏度有關；,細菌核糖體70S,大亞基（50S）,小亞基（30S）,25,用沉降系數(shù)測定物質的相對分子量；,R為氣體常數(shù)；T為熱力學溫度；S為分子的沉降系數(shù)；D為分子擴散系數(shù)；V-微分比容，即溶質密度的倒數(shù)；ρ為溶劑密度；,26,（一）離心機的分類按速度：低速、高速和超速；按用途：實驗型和

10、工業(yè)型按使用溫度：常溫和冷凍按驅動方式：手搖、油渦輪、氣動、電動和磁懸,三、離心機的分類與構造,工業(yè)離心機,2024/3/30,低速離心機nmax=6000rpm，RCFmax=6000g轉速控制不夠準確 一般無制冷，多在室溫下操作用于細胞和血樣的分離制備。,2024/3/30,高速離心機nmax= 25 000rpm，RCFmax= 89 000g轉速、溫度和時間可嚴格控制 一般有制冷系統(tǒng)用于菌體、細胞碎

11、片和大細胞器等的分離制備,2024/3/30,超速離心機nmax<100 000rpm，RCFmax<800 000g轉速、溫度和時間精密控制必須有制冷和制動裝置用于小細胞器（核糖體）和病毒等的分離制備。,臺式超速離心機,立式超速離心機,30,,驅動系統(tǒng)：油輪驅動、空氣渦輪、磁懸浮、電動防護系統(tǒng)：減震、自平衡、甲鋼外套、自限速、自限溫、自鎖定，運轉時不易打開等還有：制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、潤滑系統(tǒng)

12、配件：離心轉頭和離心管,（二）離心機的基本構造,2024/3/30,31,1. 離心轉頭的類型角式轉頭（fixed angle rotor）蕩平式轉頭 （swinging bucket rotor）垂直轉頭（vertical tube rotor）區(qū)帶轉頭 （zonal rotor）連續(xù)流動轉頭 （continuous flow rotor）分析轉頭（analytical rotor）,32,角式轉頭離心管腔與轉軸成一定

13、傾角（20～40度），角度越大沉降越結實，分離效果越好； 壁效應：管側會出現(xiàn)沉積，而影響分離效果；常用于S或沉降速度相差較大的樣品。,33,蕩平式轉頭 由多個可活動吊桶（離心套管）構成；被分離的樣品帶垂直分布于離心管縱軸；適合密度梯度離心。,34,垂直轉頭樣品顆粒的沉降距離短，離心時間短，適合于快速密度梯度離心分離不充分，停機后樣品易發(fā)生混合,35,2.離心轉頭的材質鋁合金：強度不高，易受鹽、溫度影響，易腐蝕，但易加工

14、不銹鋼：強度高、耐腐蝕、質量大提速慢、難加工鈦合金轉頭：強度高、耐腐蝕、質量小提速快、難加工、價格貴碳素：強度高、耐腐蝕、質量小提速快、易加工、價格貴,36,3. 轉頭的主要參數(shù)最大轉速及過速保護裝置最大離心力最大容量,37,4. 離心管種類一般玻璃管：只能在低速離心機上使用；塑料管：化學性能穩(wěn)定，半透明，能耐高溫消毒，但易變形，不耐腐蝕；不銹鋼管：強度大、不變形、耐腐蝕。,2024/3/30,38,離心管的注意事項：

15、對稱平衡 （包括質量和樣品高度）；提防離心管內液體外溢；超速離心一定要加滿離心管，需抽真空；杜絕使用變形老化離心管；離心前要蓋嚴管蓋(防外泄、揮發(fā)、變形)。,2024/3/30,39,四、離心機使用注意事項,40,安放：平穩(wěn)、堅固的支持面，尤其是大容量低速、高速和超速離心機；,低速大容量離心機 高速離心機 超速離心機,41,離心前務必平衡離心管和內容物（包括質量和液面高度），并對

16、稱放置；,對稱放置,,42,根據(jù)需求選擇適宜的轉子和離心管；嚴禁使用破損、裂紋和被腐蝕的轉子；嚴禁使用過期、老化、裂紋、受腐蝕的離心管；更換離心轉子時要輕取輕放，嚴禁撞擊；,裂紋 受腐蝕,43,離心前檢查密封圈，對好螺紋旋緊轉子蓋( ! )，蓋好離心機蓋；啟動后待速度達到預設值并正常運行一段時間后方可離開，若發(fā)現(xiàn)不正?，F(xiàn)象（異常噪音、抖動等）應

17、立即停機檢查原因；,44,離心過程中不能禁止打開離心機蓋；離心結束后待轉子停止轉動方可開蓋；操作結束后要擦拭離心機腔室，關掉電源，寫好使用記錄；離心機日常保養(yǎng)要防塵、防潮、防腐蝕；長期不用時，低速開機1-2次/月，0.5h/次。,五、常用離心方法及應用,離心是制備和分析生物樣品的重要手段；目前離心方法有：一般制備離心（分離血清和沉淀細胞等）超速制備離心（差速沉降和密度區(qū)帶）分析超速離心（研究生物大分子的特性）,2024/3/

18、30,差速離心差速離心法用于細胞和細胞器的分級分離；原理：利用不同的粒子在離心力場中沉降速度不同而被分離；,2024/3/30,47,差速離心法分離已破碎的細胞各組份,差速離心的分辨率不高，常用于其他分離手段之前的粗制品提取;優(yōu)點：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉子;缺點：須多次離心，沉淀中有夾帶，不能一次得到純顆粒；有“壁效應”；沉淀于管底的顆粒受擠壓，易變性失活；效率低，費時。,48,