中護(hù)微生物免疫學(xué)應(yīng)用

1、免疫學(xué)應(yīng)用,第二節(jié) 免疫學(xué)檢測(cè),一、抗原或抗體的檢測(cè),（一）抗原抗體反應(yīng)的原理和特點(diǎn),原理：在適宜條件下，抗原與相應(yīng)抗體在體外特異性結(jié)合后，出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測(cè)的各種現(xiàn)象，據(jù)此對(duì)樣品中的抗原或抗體能進(jìn)行定性、定量、定位的檢測(cè)。原則：用已知抗體檢測(cè)未知抗原，也可用已知抗原檢測(cè)未知抗體。特點(diǎn)：1.特異性 2.可見性 3.可逆性,1.特異性,一種抗原一般僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原-抗

2、體結(jié)合反應(yīng)的專一性即特異性。,2.可見性,若抗原、抗體的數(shù)量比例恰當(dāng)，抗體分子的兩個(gè)Fab段分別與兩個(gè)抗原分子結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體，反應(yīng)體系中基本無(wú)游離的抗原或抗體。此時(shí)，可形成肉眼可見的明顯反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。因此，確定抗原、抗體的最適比例十分重要，應(yīng)根據(jù)抗原的物理性狀，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行稀釋，以確定最適比例。,3.可逆性,抗原與抗體的結(jié)合為分子表面的非共價(jià)結(jié)合，結(jié)合穩(wěn)定且可逆。在一定條件下，抗原抗體結(jié)合形成的復(fù)合

3、物可被解離，如低pH、高濃度鹽、凍融等。解離后的抗原或抗體分子仍保持原有的理化特性和生物學(xué)活性。如解離后的外毒素恢復(fù)其毒性，細(xì)菌仍可存活。,（二）抗原或抗體檢測(cè)的類型,根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分因素，可將抗原抗體反應(yīng)分為：1.凝集反應(yīng)2.沉淀反應(yīng)3.免疫標(biāo)記技術(shù),1.凝集反應(yīng),概念：細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊，此類反應(yīng)稱為凝集反應(yīng)。方法：（1）直接凝集反應(yīng) （2）間接凝

4、集反應(yīng) （3）反向間接凝集反應(yīng) （4）間接凝集抑制反應(yīng) （5）協(xié)同凝集反應(yīng),（1）直接凝集反應(yīng),將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。玻片法：是用已知抗體與相應(yīng)抗原在玻片上反應(yīng)，用于抗原的定性檢測(cè)，如ABO血型鑒定、細(xì)菌鑒定。試管法：是在試管中連續(xù)稀釋待檢血清，加入已知顆粒性抗原，用于抗體的定量檢測(cè)，如診斷傷寒病的肥達(dá)試驗(yàn)。,直接凝集反應(yīng),,,顆粒性抗原,抗體,凝集,（

5、2）間接凝集反應(yīng),概念：將可溶性抗原包被在與免疫無(wú)關(guān)的載體顆粒表面，再與相應(yīng)抗體反應(yīng)，出現(xiàn)顆粒物凝集的現(xiàn)象。常用的載體： 人O型血紅細(xì)胞 聚苯乙烯乳膠顆粒,間接凝集反應(yīng),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,+,+,,可溶性抗原,載體顆粒,顆粒物的凝集,致敏抗原顆粒,抗體,間接凝集抑制反應(yīng),診斷試劑：為抗原致敏的顆粒載體及相應(yīng)的抗體，用于檢測(cè)標(biāo)本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。檢測(cè)方

6、法：為將標(biāo)本先與抗體試劑作用，然后再加入致敏的載體，若出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說(shuō)明標(biāo)本中不存在相同抗原，抗體試劑未被結(jié)合，因此仍與載體上的抗原起作用。如標(biāo)本中存在相同抗原，則凝集反應(yīng)被抑制。,2、沉淀反應(yīng),概念：血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物，此類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。方法：沉淀反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散或免疫擴(kuò)散。即可溶性抗原與相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，在比例合適處相遇時(shí)形成可見的白色沉淀。,（

7、1） 單向瓊脂擴(kuò)散,方法：將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制成瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散。結(jié)果：抗原在擴(kuò)散過(guò)程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關(guān)。取已知量抗原繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可根據(jù)所形成沉淀環(huán)的直徑，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出待檢標(biāo)本的抗原含量。應(yīng)用：本法常用于定量測(cè)定血清IgG、IgM、IgA和C3等。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)量各份標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出每份標(biāo)本所含抗原的量。,（2

8、） 雙向免疫擴(kuò)散,將抗原與抗體分別加于瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向四周擴(kuò)散，在相遇處形成沉淀線。若反應(yīng)體系中含兩種以上抗原-抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性檢測(cè)、組成和兩種抗原的相關(guān)性分析。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果1．融合性沉淀孤，說(shuō)明兩孔中抗原相同，為同一性反應(yīng)（圖1）。2．兩沉淀線獨(dú)自形成并形成交叉，說(shuō)明兩孔中的抗原完全不同，為非同一性反應(yīng)（圖2）。3. 融合性沉淀弧出現(xiàn)支線，或同時(shí)有另一條或兩條沉淀

9、線，說(shuō)明兩孔中抗原有相同成分又有不同成分，此為部分同一性反應(yīng) （圖3）。,3.免疫標(biāo)記技術(shù),概念：是利用熒光素、酶、放射性核素等標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變后者的免疫特性。優(yōu)點(diǎn)：具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點(diǎn)。是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。,（1）免疫熒光法(IF),概念：用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借

10、此鑒定或定位標(biāo)本中的抗原。常用的熒光素：有異硫氰酸熒光素(FITC)和藻紅蛋白（PE），前者發(fā)黃綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。方法：直接熒光法、間接熒光法,免疫熒光法的應(yīng)用,檢查細(xì)菌、病毒、螺旋體等抗原或抗體，用于診斷傳染病。鑒定免疫細(xì)胞表面的CD分子。檢測(cè)自身免疫病的抗核抗體。,（2）酶免疫測(cè)定(EIA),方法：將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過(guò)酶作用于底物后的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。其顏色深淺與標(biāo)記物中相應(yīng)的抗體

11、或抗原的含量呈正比，由此可測(cè)定抗原或抗體的含量。結(jié)果觀察：可用目測(cè)定性，也可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光密度（OD）值以反映抗原含量，靈敏度可達(dá)每毫升ng甚至pg水平。常用于標(biāo)記的酶：有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等。,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),是酶免疫測(cè)定中應(yīng)用最廣的技術(shù)?；驹恚杭从妹笜?biāo)記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過(guò)酶作用于底物后顯色來(lái)判斷

12、結(jié)果。 ELISA的常用的方法： 雙抗體夾心法（測(cè)定可溶性抗原） 間接法（測(cè)定抗體）,ELISA技術(shù)類型,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體酶標(biāo)記的抗原或抗體酶作用的底物,雙抗體夾心法,用已知抗體檢查特異性抗原方法：將已知抗體包被固相，加入待檢標(biāo)本，標(biāo)本中若含有相應(yīng)抗原即與固相表面的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合成分，加入該抗原特異的酶標(biāo)記

13、抗體，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體，加底物后顯色。若標(biāo)本中無(wú)相應(yīng)抗原，固相表面即無(wú)抗原結(jié)合，加入的酶標(biāo)記抗體則不能結(jié)合于固相并被洗滌去除，當(dāng)加入無(wú)色底物后，因無(wú)酶催化故不顯色。,,底物顯色定性或定量的分析,用已知抗體包被,反應(yīng)加入待測(cè)標(biāo)本和酶標(biāo)抗體,洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離,1,2,3,4,基本原理,雙抗體夾心法,,,,,1、已知抗體包 被于載體表面,3、加酶標(biāo)抗體 與抗原結(jié)合,4、加酶作用的底物

14、產(chǎn)生顏色,2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合,4、加酶作用的底物 不產(chǎn)生顏色,,,,雙抗體夾心法測(cè)抗原,,1、已知抗體包 被于載體表面,2、加待檢物無(wú)抗 原與抗體結(jié)合,3、加酶標(biāo)抗體 無(wú)抗原結(jié)合,+,-,Y,,Y,E,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,Y,,Y,Y,,,,Y,Y,Y,Y,Y,Y,間接法,用已知抗原檢查特異性抗體。方法：用已知抗原包被固相，加入待檢血清標(biāo)本，再加酶標(biāo)記的二抗，加底物觀察顯色反應(yīng)。

15、ELISA敏感性高、操作簡(jiǎn)便，配套儀器設(shè)備的發(fā)展使操作程序規(guī)范化和自動(dòng)化，并進(jìn)一步提高了穩(wěn)定性，被廣泛用于檢測(cè)多種抗原或抗體、血液及其它體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等。,（3）放射免疫測(cè)定法(RIA),概念：用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。它將放射性核素具有的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，使檢測(cè)的靈敏度達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素有：125I和131I。采用的方法分為：液相法和固相法兩種。應(yīng)用：常用于測(cè)

16、定微量物質(zhì)，如胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛等藥物，以及IgE等。,二、免疫細(xì)胞及其功能檢測(cè),檢測(cè)淋巴細(xì)胞的類別、數(shù)量與功能，是判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)的重要手段?；颊咄庵苎侵饕臉?biāo)本來(lái)源，但僅代表再循環(huán)的淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還可取胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本進(jìn)行檢查。,1.免疫細(xì)胞的類型與數(shù)量檢測(cè),E花結(jié)試驗(yàn)：人成熟T細(xì)胞表面CD2分子是綿羊紅細(xì)胞（SRBC）受體，能結(jié)合SRBC而形成花結(jié)。 E花結(jié)試驗(yàn)可用于檢

17、測(cè)T細(xì)胞數(shù)目。,花結(jié)試驗(yàn)示意圖,2.T細(xì)胞功能測(cè)定,T細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理：植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（Con A）等絲裂原以及抗CD3抗體等均能非特異性激活培養(yǎng)的T細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為體積較大、代謝旺盛、且能進(jìn)行分裂的淋巴母細(xì)胞。以此測(cè)定T細(xì)胞的功能。,3.皮膚試驗(yàn),原理：正常機(jī)體對(duì)特定抗原產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答后，再用相同抗原作皮膚試驗(yàn)，即出現(xiàn)以局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，細(xì)胞免疫正常者呈陽(yáng)性反應(yīng)，而細(xì)胞免疫低下者則呈陰性反應(yīng)。皮膚

18、試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，可幫助診斷某些病原微生物感染（結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌）、免疫缺陷病等。皮膚試驗(yàn)常用的生物性抗原多從病原體中提取，如結(jié)核菌素、麻風(fēng)菌素、鏈激酶-鏈道酶、念珠菌素、腮腺炎病毒等。,免疫學(xué)防治,第三節(jié),一、免疫預(yù)防,概念：是人為地給機(jī)體輸入抗原或抗體等，使機(jī)體獲得某種特異性免疫力的方法。分類： （一）人工自動(dòng)免疫 （二）人工被動(dòng)免疫,人工自動(dòng)免疫與人工被動(dòng)免疫的比較,（一）人工自動(dòng)免疫,概念：給機(jī)體輸入抗原物質(zhì)

19、，使免疫系統(tǒng)因抗原的刺激，產(chǎn)生類似感染時(shí)所發(fā)生的免疫過(guò)程，從而產(chǎn)生特異性免疫力。疫苗的概念：1.將細(xì)菌制作的人工自動(dòng)免疫的生物制劑稱為菌苗。2.將病毒、立克次體、螺旋體等制成的人工主動(dòng)免疫的生物制劑稱為疫苗。3.國(guó)際上將細(xì)菌制劑、病毒制劑以及類毒素統(tǒng)稱為疫苗。,人工自動(dòng)免疫所用的制劑,（1）滅活疫苗 ：病原微生物經(jīng)理化方法滅活制成。常見種類：傷寒、百日咳、霍亂、鉤端螺旋體病、流感、狂犬病、乙型腦炎疫苗 （2）減毒活疫苗：由減

20、毒或無(wú)毒力的活病原微生物制成。 常見種類：卡介苗、麻疹活疫苗、脊髓灰質(zhì)炎活疫苗。（3）類毒素：是用細(xì)菌外毒素經(jīng)0.3-0.4%甲醛液脫毒處理制成。類毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素。常用的類毒素有破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素。,活疫苗與死疫苗的比較,計(jì)劃免疫,概念：是根據(jù)傳染病的疫情和人群免疫水平的調(diào)查，將各類預(yù)防制品按照科學(xué)的免疫程序，合理有計(jì)劃地進(jìn)行預(yù)防接種，提高人群的免疫力，達(dá)到控制和消除某些傳染病的目的而采取的重要措施。免疫程序包括：兒童

21、免疫程序及成人和特殊職業(yè)、特殊地區(qū)人群的免疫程序。,兒童預(yù)防接種常用疫苗,分為三類：1.衛(wèi)生部統(tǒng)一規(guī)定的兒童計(jì)劃免疫用疫苗 ：包括卡介苗、麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗及百（日咳）、白（喉）、破（傷風(fēng)）三聯(lián)制劑等四種生物制品，控制上述6種傳染病的流行。2.衛(wèi)生部納入兒童計(jì)劃免疫管理的疫苗 ：乙肝疫苗 。3.各省（自治區(qū)、直轄市）納入兒童計(jì)劃免疫管理的疫苗 ：乙腦疫苗 、流腦疫苗、甲肝疫苗、風(fēng)疹疫苗、腮腺炎疫苗 等。,新型疫苗,指應(yīng)用基因

22、工程技術(shù)和生物化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)的疫苗。主要的種類有：1.亞單位疫苗：2.結(jié)合疫苗 3.合成肽疫苗 4.基因工程疫苗5.腫瘤細(xì)胞疫苗,,（二）人工被動(dòng)免疫,概念：是人為地給機(jī)體輸入抗體等制劑，使機(jī)體立即獲得某種特異性免疫力的方法。,人工被動(dòng)免疫所用的制劑,（1）抗毒素（2）人免疫球蛋白制劑,（一）抗毒素,概念：是將類毒素免疫馬，取其血清分離純化而成，主要用于治療和緊急預(yù)防外毒素所致疾病。特點(diǎn)：具有兩重性①特異性抗體--中和毒

23、素；②異種抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗馬血清抗體，或超敏反應(yīng)。常用種類：破傷風(fēng)抗毒素、白喉抗毒素、氣性壞疽抗毒素、以及肉毒抗毒素等。,動(dòng)物免疫血清和抗毒素,治療用動(dòng)物免疫血清：馬血清抗毒素,馬血清抗毒素的兩重性：,1、特異性抗體----中和毒素2、異種抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗馬血清抗體。,,,,,,,超敏反應(yīng),（二）人免疫球蛋白制劑,正常人血漿丙種球蛋白和胎盤丙種球蛋白：正常人丙種球蛋白是正常人血漿提取物，含IgG和IgM；而胎盤丙種球蛋白

24、則是從健康孕婦胎盤血液中提取物，主要含IgG。這兩種丙種球蛋白可用于麻疹、脊髓灰質(zhì)炎和甲型肝炎等傳染病潛伏期治療或緊急預(yù)防，以達(dá)到防止發(fā)病、減輕癥狀或縮短病程目的。靜脈注射用免疫球蛋白人特異性免疫球蛋白：源于恢復(fù)期病人及含高效價(jià)特異性抗體供血者血漿、及受類毒素和疫苗免疫者血漿。人特異性免疫球蛋白含高效價(jià)特異性抗體；人特異性免疫球蛋白在體內(nèi)持留時(shí)間長(zhǎng)，超敏反應(yīng)發(fā)生率低。常用于過(guò)敏性體質(zhì)、及丙種球蛋白治療不佳病例。,二、免疫治療,概念

25、：指針對(duì)機(jī)體低下或亢進(jìn)的免疫狀態(tài)，利用免疫學(xué)原理，人為地增強(qiáng)或抑制機(jī)體的免疫功能以達(dá)到治療疾病目的的方法。分類：免疫調(diào)節(jié):包括免疫增強(qiáng)和免疫抑制 免疫重建 免疫替代療法,（一）免疫調(diào)節(jié),概念：即用物理、化學(xué)或生物學(xué)手段調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。免疫調(diào)節(jié)劑: 免疫抑制劑 免疫增強(qiáng)劑,1.免疫增強(qiáng)劑,概念：是增強(qiáng)、促進(jìn)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的生物制劑或非生物制劑。常見種類：免疫因子

26、 微生物制劑 化學(xué)藥物 中藥制劑常用來(lái)治療免疫缺陷、病毒感染性疾病和腫瘤。,2.免疫抑制劑,概念：是一類抑制機(jī)體免疫功能的生物制劑或非生物制劑。常見種類：1.真菌代謝產(chǎn)物 2.McAb 3.抗腫瘤藥物 4.中藥制劑 5.激素特點(diǎn)：1.作用是非特異性 2.大多有

27、毒副作用,（二）免疫重建,概念：將正常個(gè)體的造血干細(xì)胞或淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移給免疫缺陷個(gè)體，以恢復(fù)其免疫功能。方法：造血干細(xì)胞移植 胚胎肝移植 免疫效應(yīng)細(xì)胞輸注,1.造血干細(xì)胞移植,概念：是取患者或健康人的骨髓回輸給患者，讓骨髓中的干細(xì)胞進(jìn)入患者體內(nèi)定居、分化、增殖，使患者恢復(fù)造血功能和免疫力。類型：1.自體骨髓干細(xì)胞移植 2.異體骨髓干細(xì)胞移植 3.臍血干細(xì)胞移植應(yīng)用：

28、1.免疫缺陷病 2.再生障礙性貧血 3.白血病,2.免疫效應(yīng)細(xì)胞輸入,是將對(duì)疾病有免疫力的供者的免疫效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移給其他個(gè)體，或自體的免疫效應(yīng)細(xì)胞經(jīng)體外處理后回輸自身，以發(fā)揮治療疾病的作用。分類： 同種淋巴細(xì)胞輸入 自體免疫效應(yīng)細(xì)胞輸入,（三）免疫替代療法,是因機(jī)體缺乏某種免疫活性物質(zhì)，通過(guò)給機(jī)體輸入該物質(zhì)，從而維持機(jī)體的功能。,總結(jié)：抗原或抗體檢測(cè)的機(jī)制,在適宜條件下，抗原與相應(yīng)抗