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文檔簡介
1、1生物樣品微量藥物的分析技術(shù)體內(nèi)藥物分析是指體內(nèi)樣品(生物體液、器官或組織)中藥物及其代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。體內(nèi)藥物分析與體內(nèi)藥代動力學(xué)研究和臨床治療藥物監(jiān)測密切相關(guān),它直接關(guān)系到藥物的體內(nèi)作用機(jī)制探討與質(zhì)量評價和藥物臨床使用的安全、有效與合理。藥物產(chǎn)生藥理作用的強(qiáng)度與其在體內(nèi)作用部位(受體組織)的濃度直接相關(guān),而藥物在體內(nèi)主要依靠血液輸送至作用部位,因此血藥濃度可作為藥物在作用部位濃度的表觀指標(biāo),即血液是體內(nèi)藥物分析的
2、主要樣品。另外,尿液、唾液、頭發(fā)和臟器組織等也可作為體內(nèi)樣品。藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們在體內(nèi)的變化規(guī)律對母體藥物的藥理學(xué)與毒理學(xué)評價極為重要;機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機(jī)體重要的生理過程,其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。所以,體內(nèi)特定藥物代謝物和機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)也是體內(nèi)藥物分析監(jiān)測的目標(biāo)。藥物進(jìn)入體內(nèi)后,其化學(xué)結(jié)構(gòu)與存在狀態(tài)均可能發(fā)生顯著變化。在體液中,藥物的存在形式多樣化,除游離
3、型的原形藥物或其代謝物,也有原形藥物或其代謝物與葡萄糖醛酸等內(nèi)源性小分子經(jīng)共價結(jié)合的結(jié)合物(或稱綴合物,conjugate),還有與蛋白質(zhì)分子經(jīng)氫鍵及其他分子間力結(jié)合的結(jié)合型藥物;而且藥物及其代謝物的濃度通常很低、干擾物質(zhì)多。在測定體內(nèi)藥物及其特定代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)時,除少數(shù)情況將體液作簡單處理后可直接測定外,通常在測定之前要對體內(nèi)樣品進(jìn)行分離凈化與濃集等樣品前處理,從而為體內(nèi)樣品中藥物的測定提供良好的環(huán)境與條件。常用的樣品前處
4、理方法包括:去除蛋白質(zhì)、綴合物水解、化學(xué)衍生化、分離濃集等方法。其中,去除蛋白質(zhì)法主要有溶劑沉淀法、中性鹽析法、強(qiáng)酸沉淀法、超濾法及熱凝固法;分離濃集法通常采用液相萃取、固相萃取與膜分離技術(shù)。從藥物的研究到臨床應(yīng)用,藥物質(zhì)量的正確評價尺度是有效性和安全性,即根據(jù)藥物在體內(nèi)的表現(xiàn)作出評價。新藥進(jìn)入臨床之前,首先在試驗動物體內(nèi)進(jìn)行藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究。所以,體內(nèi)藥物分析的對象不僅是人體,也包括試驗動物。對體內(nèi)藥物進(jìn)行研究時,要求分析方
5、法的靈敏度、專屬性和可靠性的程度均較高,建立有效的分析方法是體內(nèi)藥物分析的首要任務(wù)。其次,在新藥研究過程中,按照國家新藥注冊審批有關(guān)規(guī)定,要提供藥物在動物和人體內(nèi)的藥物動力學(xué)參數(shù)、生物利用度及血漿蛋白結(jié)合率等基本數(shù)據(jù),這些研究工作要靠體內(nèi)藥物分析來完成。再者,為保證臨床用藥安全有效,體內(nèi)藥物分析也應(yīng)為治療藥物監(jiān)測(TherapeuticDrugMoniting,TDM)提供準(zhǔn)確的血藥濃度測定值,并對血藥濃度進(jìn)行具體分析和合理解釋,提供藥
6、學(xué)情報和信息,參與指導(dǎo)臨床合理用藥、確定最佳劑量、制訂治療方案。另外,監(jiān)測和研究體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的濃度變化,對于某些疾病的診斷及治療具有重要意義;對于麻醉藥品和精神藥品濫用的檢測和運(yùn)動員體內(nèi)違禁藥物的監(jiān)測,也必須依據(jù)體內(nèi)藥物分析手段和技術(shù)才能完成。3體內(nèi)樣品。在特殊情況下亦有采用乳汁、精液、淚液等生物體液。二、體內(nèi)樣品的采集與制備(一)血樣血藥濃度通常是指血漿(plasma)或血清(serum)中的藥物濃度,而不是指全血藥物濃度。因為當(dāng)藥
7、物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度時,血漿中藥物濃度被認(rèn)為與藥物在作用部位(靶器官)的濃度緊密相關(guān),即血漿中的藥物濃度可以反映藥物在體內(nèi)作用部位的狀況。所以,血漿和血清是體內(nèi)藥物分析最常用的樣本,其中選用最多的是血漿。1血樣的采集供測定的血樣應(yīng)代表整個血藥濃度,所以應(yīng)待藥物在血液中分布均勻后取樣。通常從靜脈采集血樣,并根據(jù)血中藥物濃度和分析方法靈敏度的要求,一般每次采血1~5ml;動物實驗時,采血量不宜超過動物總血量的十分之一。血樣通常從肘靜脈采
8、集,有時從毛細(xì)血管采血(成人多從手指或耳垂取血,小兒多從腳趾取血)用于臨床化驗。2血漿的制備將采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中,混合后,以約1000?g離心力,離心5~10分鐘,使與血細(xì)胞分離,所得淡黃色上清液即為血漿。最常用的抗凝劑是肝素(heparin)。肝素是體內(nèi)正常生理成分,因此不致改變血樣的化學(xué)組成或引起藥物的變化,一般不會干擾藥物的測定。其他抗凝劑是一些能與血液中的Ca2結(jié)合的試劑,如:EDTA、枸櫞酸鹽、氟化鈉、草酸等。
9、目前,采血常用的負(fù)壓式采血管通常預(yù)加有抗凝劑。3血清的制備將采集的靜脈血液置離心試管中,放置30分鐘~1小時。然后以約1000?g離心力,離心5~10分鐘,上層澄清的淡黃色液體即為血清。因藥物與纖維蛋白幾乎不結(jié)合,所以血漿與血清中的藥物濃度通常是相同的。作為血藥濃度測定的樣品,血漿和血清可任意選用。但無論是采用血漿還是血清,現(xiàn)有的文獻(xiàn)、資料所列的血藥濃度,均系指血漿或血清中藥物的總濃度(游離的和與血漿蛋白結(jié)合的總濃度)。血漿比血清分離得
10、快,而且制取的量約為全血的50%~60%(血清只為全血的20%~40%),多數(shù)研究者使用血漿樣品。若血漿中含有的抗凝劑對藥物濃度測定有影響時,則應(yīng)使用血清樣品。4全血的制備將采集的血液置含有抗凝劑的試管中,但不經(jīng)離心操作,保持血漿和血細(xì)胞處于均相,則稱為全血(wholeblood)。全血樣品放置或自貯存處取出恢復(fù)室溫之后,可明顯分為上、下兩層,上層為血漿、下層為血細(xì)胞,但輕微搖動即可混勻。若需專門測定平均分布于血細(xì)胞內(nèi)、外的藥物濃度,則
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