藥物分析中的新型樣品處理方法的研究及應用.pdf

1、在藥物分析中，樣品處理在整個分析過程中起著關鍵性的作用，其主要目的是將待分析物從其基質中提取、分離出來，同時兼具純化、富集的作用，從而達到提高準確性、特異性及靈敏度的目的。理想的分析樣品處理方法一般要求其具有高的工作效率，即有好的提取分離效率，兼具純化等作用，并且操作簡單，處理步驟少，從而減少因多步處理而出現(xiàn)的污染與損失。因此，高靈敏度，快速，簡便的樣品處理方法成為了現(xiàn)今的一個研究熱點。
　　 目前，最常用的樣品處理方法大多為離

2、線方法，如溶劑萃取、超聲萃取、蛋白沉淀等傳統(tǒng)技術。微萃取技術以其具有高選擇性的萃取原理保證了良好的回收率與重現(xiàn)性，是一種有效的分析樣品前處理方法，在近些年發(fā)展異常迅速。常用作前處理的方式主要有固相微萃取，液相微萃??；此外，微透析，超濾法等技術也是最常用的幾種方法。
　　 在藥物分析特別是生物藥物分析中，大分子的分離或去除，往往是樣品前處理的主要目的和關鍵步驟，其不但影響分析結果的準確度與精密度，而且是制約工作效率的關鍵；目前常使

3、用的方法主要有各類沉淀離心法、凝膠滲透法以及透析技術等，然而這些技術大多存在耗時、操作步驟復雜、成本較高等不足之處。超濾技術是一種相對簡便的樣品前處理方法，但是傳統(tǒng)的超濾裝置所采用的膜一般都是平膜的形式，該種裝置在超濾過程中會產(chǎn)生很大的濃差極化，間接導致膜滲流量下降和分離效率降低，濾液難于收集，同時昂貴的分析成本也使其難于普及。本課題采用了一種新型的中空纖維離心超濾技術，在離心超濾時離心力與中空纖維膜平行，離心力消除了膜表面的濃差極化現(xiàn)

4、象，同時簡化了有機溶劑提取或是加入沉淀劑時的繁瑣、費時的步驟，避免了稀釋作用，也降低了分析成本。
　　 分析樣品前處理的另一重要任務是對分析目標的富集與濃縮，用以提高分析方法的靈敏度，特別是對于從硬件提高分析靈敏度有困難的分析技術，如毛細管電泳。傳統(tǒng)的富集手段主要采用液液萃取、共沉淀等，近年來固相微萃取(SPME)、各類液液微萃取技術(LPME)以及頂空富集技術蓬勃發(fā)展，彌補了傳統(tǒng)前處理技術的不足。然而，這些技術均屬于離線的分離

5、、富集技術，都存在著操作步驟繁瑣、處理過程耗時、費用高等不足，因此，各類在線富集技術的研究與應用受到人們的日益關注。毛細管電泳(CE)是上世紀80年代發(fā)展起來的高效分離技術，但是，因其極小的進樣體積以及較短的檢測光程，使CE在微量及痕量組分的分離分析中受到很大的限制。雖然人們可通過采用特殊設計的檢測池或應用高靈敏度的檢測器提高檢測靈敏度，但昂貴的儀器價格及對某些樣品性質的特殊要求，限制了它的應用與普及。一個更可行、更合理的解決方法是樣品

6、的在線（或在柱）富集。這種方法是通過對樣品、背景緩沖溶液的組成以及進樣程序進行簡單的調控而實現(xiàn)，無需對儀器進行改造。
　　 毛細管電泳場放大富集技術是毛細管在線富集技術的一種，其原理是是采用電遷移進樣將低濃度的樣品溶液加入到充有高濃度緩沖液的毛細管中。樣品進入分離通道后，進樣口端的預進溶液的電場強度大大高于毛細管內的電場強度，因此，開始時樣品以高遷移速率運動，很快到達低電場強度的背景溶液中，此時遷移速率降低，樣品離子在樣品溶液和

7、背景電解質交界處發(fā)生堆積而得到富集。
　　 本課題采用毛細管場放大在線富集的樣品處理技術，對藥品中微量毒性有效成分烏頭堿、生物樣品以及藥物制劑中的微量成分進行了分析，為藥物制劑的質量控制提供了可靠的方法。
　　 一、新型中空纖維離心超濾裝置在樣品處理中的應用
　　 （一）中空纖維離心超濾-HPLC法測定吲哚美辛脂質體包封率
　　 目的：利用大分子截留小分子通過的原理，采用新型中空纖維離心超濾裝置，測定脂質

8、體中未包封的小分子藥物，從而計算脂質體的包封率。
　　 方法：取吲哚美辛脂質體約0.2mL，置玻璃管中，將15cm中空纖維彎成U型后插入該管，至離心機中，在4000r/min條件下離心20min，濾液直接注入色譜系統(tǒng)，測定游離藥物濃度。另取吲哚美辛脂質體加甲醇破乳后分析測定總藥物濃度，并計算包封率。色譜分析條件采用Hypersil C18（150×4.6mm，5μm）為色譜柱，以0.1mol·L-1冰醋酸-乙腈(v/v=45：5

9、5)為流動相，檢測波長為320nm，流速為1.0mL/min。
　　 結果：中空纖維離心超濾法能將脂質體和游離藥物在平衡狀態(tài)下快速分離，且脂質體和其他大分子物質不能通過中空纖維膜，而游離藥物自由通過超濾膜，所獲得的超濾液可以直接進行色譜分析，分析游離藥物方法的過濾回收率大于97.0％。分析總藥物方法的過濾回收率大于97.5％。相對標準偏差小于1.0％(n=5)。
　　 結論：采用中空纖維離心超濾法分析吲哚美辛脂質體的包封

10、率，簡單快速，可作為脂質體的質量控制方法。
　　 （二）新型中空纖維離心超濾裝置進行樣品前處理測定人體血漿中頭孢克洛的含量
　　 目的：建立應用新的微型中空纖維離心超濾裝置去除血漿中的大分子的樣品前處理方法，研究克服蛋白結合對游離藥物濃度影響的方法，并結合HPLC測定頭孢克洛的血藥濃度。
　　 方法：0.2mL血漿經(jīng)酸化后轉移至自制玻璃離心管中，將中空纖維折成U型后，離心法20min后，將所得濾液直接進樣分析。采

11、用Diamonsil（鉆石）C18色譜柱（250×4.6mm，5μm），流動相為乙腈：四氫呋喃：10mmol·L-1磷酸二氫鈉水溶液(pH2.9)(6：5：89)，流速為1.0mL·min-1，內標為頭孢拉定，在265nm波長處檢測。
　　 結果：在pH=2的條件下，血漿蛋白結合的藥物基本釋放，平均提取回收率不低于86.8％，平均方法回收率為99.2％。血藥濃度在0.06-30.72μg．mL-1范圍內線性關系良好(r=0.99

12、96)，最低檢測限為0.02μg·mL-1，日內RSD均小于1.8％，日間RSD均小于3.6％。
　　 結論：該方法采用新型中空纖維離心超濾裝置，僅通過調節(jié)pH后離心的一步操作就完成了樣品處理過程，方法簡便快速；同時避免溶劑稀釋，提高了靈敏度；所得濾液純凈，可直接進樣分析。適用于頭孢克洛的臨床藥動學研究和血藥濃度檢測。
　　 二、毛細管電泳場放大富集技術檢測骨刺消痛液中的烏頭堿類毒性成分
　　 目的：建立毛細管電

13、泳場放大富集技術測定骨刺消痛液中烏頭堿類痕量毒性成分的方法。
　　 方法：取一定量樣品經(jīng)過酸化、乙醚脫脂溶性雜質、堿化，再用乙醚萃取后，氮吹，用10％乙腈復溶后，采用未涂層石英毛細管(50μmi.d.×50cm，有效長度42cm)為分離通道。電動進樣，進樣前預進水10s，在進樣30s，進樣電壓12kV。進樣后在50mmol·L-1磷酸二氫鈉(pH=9)-乙腈(90:10)的運行緩沖溶液中運行，運行電壓10kV。紫外檢測波長235