生物反應(yīng)工程實驗講義1

1、1實驗一實驗一辣根過氧化物酶的活力測定及辣根過氧化物酶的活力測定及過氧化物酶的動力學(xué)參數(shù)測定過氧化物酶的動力學(xué)參數(shù)測定一、目的一、目的1.掌握辣根過氧化物酶的活力測定方法；2.學(xué)會酶的動力學(xué)參數(shù)的測定方法；掌握Hanes作圖法。3.學(xué)會可調(diào)微量進(jìn)樣器的結(jié)構(gòu)及使用；4.了解分光光度計儀器的使用。二、原理二、原理過氧化物酶催化以下反應(yīng)：2H2O2→O22H2O這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類(hemeproteins)。過氧化物

2、酶在生物界分布極廣，在細(xì)胞代謝的氧化還原過程中起重要的作用。辣根過氧化物酶(hseradishperoxidase，簡稱HRP，EC1111７)是植物中研究得最深入的一種過氧化物酶，早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結(jié)晶。隨著酶標(biāo)技術(shù)的發(fā)展，作為標(biāo)記酶，辣根過氧化物酶是目前使用最普遍的一種酶，它的標(biāo)記物既能用于定位檢測，也能用于定量測定。因此研究辣根過氧化物酶的動力學(xué)性質(zhì)很有實際意義。是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)

3、，Mr在40000左右，等電點7.2溶于水，溶解度為5％(W／W)，溶液呈棕紅色，透明。HRP可溶于０.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。本實驗以愈創(chuàng)木酚（鄰甲氧基苯酚）和H2O2為底物，過氧化物酶H2O2放出新生態(tài)氧使無色的愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色的四鄰甲氧基連酚，反應(yīng)式如下：過氧化物酶活力的大小在一定范圍內(nèi)與產(chǎn)物顏色的深淺呈線性關(guān)系，該產(chǎn)物在470nm處有最大的光吸收，故可通過測定A470的變化以測定過氧化物酶的活

4、力。一般以引起1min內(nèi)0.001吸廣度值的變化量為一個酶活力單位U。酶促反應(yīng)速率與各種因素有關(guān)，如底物濃度、酶濃度、溫度等。酶的底物與酶促反應(yīng)速率的一般符合MichaelisMenten方程，即3反應(yīng)物對照樣品緩沖溶液愈創(chuàng)木酚溶液酶液2.91ml0.05ml0ml2.90ml0.05ml0.01ml加好反應(yīng)物，搖勻，在470nm讀出A470值，為t=0時的讀數(shù)。立即加0.01ml0.04molLH2O2于兩個比色皿中，立即搖勻記時，每

5、隔15S30S讀數(shù)一次，25min。將所測樣品的A470值減去相應(yīng)時間的對照的A470值為實際的樣品的A470值。2.過氧化物酶的動力學(xué)參數(shù)測定將0.1molL的H2O2，用蒸餾水稀釋成6種不同的濃度，按下表操作：表2Km測定操作過程表測定操作過程表123456組別對照1112對照2122對照3132對照4142對照5152對照6162緩沖溶液(pH6.5)ml2.912.902.912.902.912.902.912.902.912.

6、902.912.90愈創(chuàng)木酚溶液0.05ml酶液ml—0.01—0.01—0.01—0.01—0.01—0.01濃度0.010.020.040.060.080.10底物H2O2體積0.04ml反應(yīng)25min記錄每隔5S10S依次將pH6.5緩沖溶液、愈創(chuàng)木酚加入比色皿中，（對照中不加酶液）檢測樣中加入0.01ml酶液，搖均；再分別加入不同濃度的H2O20.04ml，立即搖均，記時，每隔5S10S讀數(shù)。用對照樣作空白，進(jìn)行調(diào)零。五、記錄及