q-pcr講解..

1、唯我所欲、精準溯源—qPCR實驗解析,,北京全式金生物技術有限公司,2,qPCR技術絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法 qRT-PCR,概述,核酸提取cDNA 合成(兩步法 qRT-PCR)引物設計方法和原則,樣品準備,必要的對照、內(nèi)參、標準選擇相應的熒光檢測方法試劑選擇,實驗設計,分析擴增曲線、溶解曲線和標準曲線實驗常見問題分析,數(shù)據(jù)分析,3,qPCR基本概念,4,常規(guī)PCR與實時熒光定量PCR,常規(guī)PCR：借助電泳

2、對擴增反應的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析實時熒光定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終對起始模板進行精確的定量分析,5,熒光定量PCR儀器工作原理,激發(fā)光發(fā)射源接收裝置PCR反應模塊,qPCR 參數(shù): 擴增曲線,擴增曲線、標準曲線反映qPCR重要指標,qPCR 參數(shù): 溶解曲線,,溶解曲線(下左): 溫度和熒光值的關系，在擴增結束后進行處理后溶解曲線 (下右): 溫度和熒光值的

3、關系，并取其導數(shù)，更為常用應用:指示特異性，最為理想的為單峰；如出現(xiàn)多峰證明反應不特異或存在引物二聚體,確認反應特異性，增加數(shù)據(jù)可信度,qPCR的數(shù)學原理,理想的PCR反應：Xn=X0×2n非理想的PCR反應：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時取對數(shù)得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n)整理方程式得:log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn將C(t)和

4、達到C(t)值時終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得：log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t) 初始濃度的對數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關系,n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率,9,MIQE qPCR國際標準,提出發(fā)表文章時所要求的最低限度的必要信息標準。對qPCR的術語；概念；研究與臨床應用；樣本的采集、處理和制備；核酸的

5、質(zhì)量控制；反轉錄；qPCR過程；數(shù)據(jù)分析等方面的操作標準和規(guī)范都做了詳盡的闡述。,10,,qPCR常用定量方式,qPCR 常用實驗方法,TaqMan® / TaqMan-MGB® Molecular BeaconSYBR Green I MGB EclipseTM Probes ScorpionsTMOthers...,qPCR 常用實驗方法,簡單 成本較低,適用于多重PCR 特異性較好,可進行SNP檢

6、測特異性非常好,熒光標記方法選擇,醫(yī)療檢驗TaqMan探針法特異準確科研SYBR方法便宜方便TaqMan探針法要求嚴格的相對定量,14,,常用定量方法——相對定量vs絕對定量,絕對定量微生物檢測：病毒拷貝數(shù)轉基因檢測：轉基因拷貝數(shù)相對定量（差異）基因表達差異,16,qPCR常用試驗方法,絕對定量標準曲線由已知濃度的RNA、質(zhì)粒或合成的寡核苷酸鏈生成；定量未知模板；標準樣品和未知樣品必須同時反應；相對

7、定量 ??CT Method：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因； 參照樣品基因與目的基因可以同時反應，也可以單獨反應； 雙標準曲線法：對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達；,絕對定量,由標準品計算未知樣品的拷貝數(shù),利用管家基因校正并計算目的基因倍數(shù)關系,相對定量,一步法vs兩步法qPCR,qRT-PCR 實驗條件,可

8、進行PCR或qPCR需要基因特異性引物高通量使用同類的RNA(i.e. single cell) 適合從大量的RNA樣本中得到少量基因（數(shù)目）的信息,先進行cDNA合成再進行PCR高效的第一鏈合成可為下游實驗提供cDNA適合從少量的RNA樣本中得 到大量基因（數(shù)目）的信息,根據(jù)試驗情況進行選擇,21,qPCR技術絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法 qRT-PCR,概述,核酸提取cDNA 合成(兩步法 qRT-PC

9、R)引物設計方法和原則,樣品準備,必要的對照、內(nèi)參、標準選擇相應的熒光檢測方法試劑選擇,實驗設計,分析擴增曲線、溶解曲線和標準曲線實驗常見問題分析,數(shù)據(jù)分析,22,核酸提取,RNA 提取,TransZol TransZol UpTransZol Plant EasyPure RNA K

10、itEasyPure Viral DNA/RNA Kit EasyPure Plant RNA KitEasyPure Blood RNA Kit TransZol Up Plus RNA KitEasyPure miRNA Kit,好的qPCR結果來源于高質(zhì)量的模板,DNA 提取,BloodZolPlantZolEasyPure Genomic DNA KitEasyPure Plant

11、 Genomic DNA KitEasyPure Blood Genomic DNA KitEasyPure Marine Genomic DNA KitEasyPure Bacteria DNA Kit,23,cDNA合成 (兩步法 qRT-PCR),好的qPCR結果依賴于成功的cDNA合成,反轉錄cDNA影響qPCR敏感度全長cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT): 只識別mRNA，合成cDNA序列靠近3

12、 ’隨機引物: 隨機合成序列，可能合成非編碼RNA，造成定量結果高估兩者混合結合兩者優(yōu)點,24,絕對定量和相對定量實驗要求,25,絕對定量,模板 盡可能選擇與目的基因序列相同以保證擴增效率相同 來源 質(zhì)粒DNA 純化PCR產(chǎn)物 Reference DNA (genomic DNA) 精度 每次加樣要保證在2 μl以上，減少誤差 梯度 至少3個點，最好5個點,26

13、,相對定量內(nèi)參基因選擇,內(nèi)參基因的作用 檢測樣本材料中RNA是否降解 糾正樣本加樣的差異 校正cDNA合成速率差異 校正PCR抑制劑的影響常用內(nèi)參基因 GAPDH β-actin 18SrRNA選擇 不同的物種選擇不同的內(nèi)參基因，有時候可選擇組合內(nèi)參基因。,27,,引物設計方法和原則,,Blast確定引物特異性,引物設計,29,網(wǎng)絡免費設計軟件,Primer3（primer3.ut.

14、ee） 引物和雙標記水解探針的設計 Tm的計算MFold（ http://mfold.rna.albany.edu） 引物和擴增產(chǎn)物二級結構的預測 二級結構的穩(wěn)定性(delta G) 和融解溫度(Tm)BLAST（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/） 結構特異性,30,SYBR引物設計原則,SYBR-Green引物 引物長度18-30

15、bps，產(chǎn)物長度范圍100~400bp G/C 含量: 40-60% 避免引物內(nèi)含有互補序列 (尤其是3’端) 避免3’ 端錯配 3’端不能出現(xiàn)連續(xù)三個以上的G或C 避免3’端出現(xiàn)T堿基 設計跨內(nèi)含子引物,31,TaqMan探針和引物設計,32,qPCR技術絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法 qRT-PCR,概述,核酸提取cDNA 合成(兩步法 qRT-PCR)引物設

16、計方法和原則,樣品準備,必要的對照、內(nèi)參、標準選擇相應的熒光檢測方法試劑選擇,實驗設計,分析擴增曲線、溶解曲線和標準曲線實驗常見問題分析,數(shù)據(jù)分析,33,,對照設置,34,對照設置,陰性對照Negative control: No template (NTC)Use: 檢驗是否有模板污染No reverse transcriptase (NRT): Use: 檢驗RNA樣品中是否有DNA污染No amplificatio

17、n control (NAC): Use: 檢驗是否有聚合酶污染No probe control (NPC):Use: 檢驗熒光污染Buffer: Only contains bufferUse: 檢驗背景熒光陽性對照Calibrator: 可以用帶有PCR擴增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸； 質(zhì)粒DNA；克隆到質(zhì)粒的cDNA；體外反轉錄的RNA；Reference RNA pools；來自于特定的生物體樣本的RNA或

18、DNA及國際上公認的生物學標準物。Standard curve,35,,定量方式選擇,36,定量方式選擇,SYBR Green適用 -特異性要求不是特別高的反應，分子數(shù)（拷貝數(shù)）超過1000的反應 -探針實驗前，進行預實驗 -PCR條件非常成熟，無二聚體，無非特異擴增TaqMan適用 -特異性要求較高的實驗 -多重PCR（標記不同的熒光基團） -SNP -靈敏度要求較高的實驗,

19、標準曲線法和??Ct法,相對定量方法基因表達差異目的基因，內(nèi)參基因??Ct只依靠Ct值用于大通量（很多基因，如芯片結果）計算簡單估計性的結果要求目的基因和內(nèi)參基因擴增效率都比較好雙標準曲線法結果精確對擴增效率要求不高構建目的基因與內(nèi)參基因的標準品相當于兩個絕對定量每次反應都要作標準曲線,雙標準曲線法,雙標準曲線法用目的基因和內(nèi)參基因的標準品分別獲得標準曲線處理與未處理樣品同時擴增目的基因和內(nèi)參基因，獲得C

20、(t)值通過標準曲線計算目的基因和內(nèi)參基因的絕對拷貝數(shù)用內(nèi)參基因對目的基因均一化均一化之后的目的基因值相比得出處理與未處理的樣本中目的基因的表達差異,39,實例分析,相對定量實例,實驗目的： 比較病毒刺激細胞后，細胞抗病毒基因ISG54的表達情況差異。樣品：病毒刺激細胞，對照細胞試劑： TransZol Up、TransStart Top Green qPCR SuperMix、 TransScript

21、TM II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix其它材料： 內(nèi)參引物（GAPDH） 目的基因引物（ISG54）,對照樣品及內(nèi)參引物,確定對照樣本（Calibrator） 多個樣本比較情況下，其中之一作為對照樣本，其它所有樣本中目的基因的表達都相對于對照上調(diào)或下調(diào)。確定內(nèi)參基因 （GAPDH或β-actin ） 在所有樣本中恒定表達的已知基因，該內(nèi)參基因可以是一個或多個。內(nèi)參基

22、因一般是穩(wěn)定表達的，但在個別物種中可能并非穩(wěn)定表達，此時需選擇多個內(nèi)參引物。,數(shù)據(jù)分析,擴增曲線,溶解曲線,GAPDH內(nèi)參基因,擴增曲線,溶解曲線,ISG54目的基因,數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)分析,△△Ct = △Ct(實驗) — △Ct(對照) △Ct(實驗) = Ct（實驗，目的基因） — Ct（實驗，內(nèi)參基因） △Ct(對照) = Ct（對照，目的基因） — Ct（對照，內(nèi)參基因）2 －△△Ct =2 －（－3.22）= 9.32病

23、毒刺激細胞后，細胞中的ISG54抗病毒基因表達上調(diào)了9.32倍。,2 －△△Ct,如何制作標準品,以Adeasy腺病毒質(zhì)粒為例： 一個質(zhì)粒 MW= 36820 bp × 2 ×330 = 2.43 ×107 2.43 ×107 g/mol

24、 6.023 ×1023個分子/mol = 4.03 ×10-17 g,,一個質(zhì)粒(1 copy)的質(zhì)量 =,-計算出拷貝數(shù)（copies/ul）-梯度稀釋制作標準品（大體積稀釋10 μ

25、l to 90 μl ）-定量PCR，檢查Ct值差異-產(chǎn)物跑膠鑒定大小,如何計算擴增效率,使用標準曲線確定引物擴增效率,Y=-3.488 × logX+55.03R2=0.999E=93.5%,E=10(-1/slope) －1,利用TaqMan法研究ERBB2 在正?；蛉橄倌[瘤組織標本中的表達差異已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達異常，因此可以作為一個檢測標準選用GAPDH作為內(nèi)標基因FAM標記的ER

26、BB2探針VIC標記的GAPDH探針構建標準曲線雙重PCR反應陰性對照無RNA對照（空白）無逆轉錄酶對照（基因組）,實例分析-2,標準曲線,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 – FAM detection for ERBB2,樣品擴增：正常vs腫瘤,,PMT1-FAM detection- ERBB2,PMT2-VIC detection- GAPDH,實驗結果,ERBB2

27、表達,GAPDH表達,實驗結果,HealthyRNA,TumorRNA,,GAPDH,ERBB2,10951052,21302492,9550085730,136000130800,Copies ng/ µl Total RNA,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.0172492

28、/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.011,0.018,實驗結果,ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t) =1.51-1.93結果與雙標準曲線法相近,53,,參照染料（ROX）,參照染料選擇,標準化熒光信號調(diào)整非PCR因素造成的誤差，如加樣誤差提供較穩(wěn)定的基線部分儀器在使用前會使用標準化熒光信號進行校正參照染料的使用由儀器決定ABI a

29、nd Stratagene 使用ROXBio-Rad 使用標準化熒光信號Roche, Corbett, Cepheid 和 MJ Research不使用內(nèi)參染料,使用內(nèi)參染料使數(shù)據(jù)更加準確,55,qPCR技術絕對定量VS相對定量一步法VS兩步法 qRT-PCR,概述,核酸提取cDNA 合成(兩步法 qRT-PCR)引物設計方法和原則,樣品準備,必要的對照、內(nèi)參、標準選擇相應的熒光檢測方法試劑選擇,實驗設計,分析擴增曲線、

30、溶解曲線和標準曲線實驗常見問題分析,數(shù)據(jù)分析,56,,判斷數(shù)據(jù)有效性,,57,用擴增曲線檢驗qPCR體系用融解曲線檢驗qPCR體系用標準曲線檢驗qPCR體系用No-Template Control( NTC)檢驗qPCR體系（引物）用No RT Control檢驗qPCR體系（模板）,擴增曲線,平滑起始無擴增起峰時間正常NTC和NRC無擴增 或擴增起峰較晚,CT值是判斷實驗成功與否的重要參考,Ct值的可信范圍,臨

31、床檢驗小于33科學研究小于38內(nèi)參基因小于20，樣品間差距不超過1復孔不超過0.5,CT值是判斷實驗成功與否的重要參考,60,溶解曲線分析,呈現(xiàn)單峰峰的寬度較小NTC和NRC均無較高的峰出現(xiàn),61,擴增效率,r2=0.999 Slope= -3.364E=10(-1/slope) －1,r2: 0.95~1 Slope: -3.58~ -3.10E: 90%~110%,熒光定量PCR-- NTC,熒光

32、定量PCR-- NTC,,引物二聚體,No RT Control,RT反應中的陰性對照，即不加入RT酶的反應目的：檢測RNA中是否有基因組DNA的殘留將No RT Control產(chǎn)物與正常cDNA同時進行qPCR觀察其結果，判斷正常cDNA的擴增結果是否可信、該RNA是否可用,熒光定量PCR標準數(shù)據(jù)參考范圍,66,,熒光定量PCR問題解析,67,擴增曲線分析,基線設置是否正確基線校準基線開始值(3-10) 基線終止值（

33、指數(shù)期之前）閾值設置是否正確設置在指數(shù)增長期(可自動或手動設置）,68,擴增曲線分析,初始擴增不規(guī)則主要由于模板中存在抑制物。樣品擴增過早是由于初始模板濃度太高。,69,擴增曲線分析,曲線不平滑,探針或熒光染料品質(zhì)不好儀器使用過度，熒光收集不穩(wěn)定儀器未經(jīng)過校正（包括自動校正或ROX校正)體系中抑制物較多，導致熒光不穩(wěn)定,擴增曲線問題-精密度差,加樣誤差，體系配置錯誤，反應液沒有混勻。低拷貝基因或模板濃度過高或過低。未引入

34、校正系統(tǒng)。,融解曲線分析,分析擴增產(chǎn)物的特異性: 單峰證明特異檢測 : - 基因組污染 (NTC出現(xiàn)與目的條帶相同的峰) - 非特異擴增(不同的Tm) - 引物二聚體(NTC出現(xiàn)比目的基因Tm小的峰), …,72,標準曲線分析,可能的影響因素 1. 稀釋精度 2. 加樣精度 3. 反應體系的優(yōu)化 4. 模板降解,