影響pcr的因素

1、 影響 影響 PCR 反應(yīng)的條件 反應(yīng)的條件(1) 引物： 引物是 PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互補(bǔ)的程度。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp 左右。②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp 為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb 的片段。③引物堿基：G+C 含量以40-60%為宜，G+C 太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATG

2、C 最好隨機(jī)分布，避免5 個(gè)以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致 PCR 失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)

3、據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol 或10～100pmol，以最低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。(2)酶及其濃度 目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul 時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度

4、過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。(3)dNTP 的質(zhì)量與濃度 dNTP 的質(zhì)量與濃度和 PCR 擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP 粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP 溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH 或1M Tris.HCL 的緩沖液將其 PH 調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使 dNTP 降解。在 PCR 反應(yīng)中，dNTP 應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種 dNTP 的

5、濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低 PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP 能與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。(4)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是 PCR 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS 的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的

6、核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 DNA 結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于 PCR 反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于 PCR 擴(kuò)增。RNA 模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。(5)Mg2+濃度

7、 Mg2+對(duì) PCR 擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR 反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為200umol/L 時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L 為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。Trouble shooting guide1．假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量， ④PC

8、R 循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有 Taq 酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因?yàn)槊傅幕钚詥适?/p>

9、或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí) PCR 時(shí)忘了加 Taq 酶或電泳時(shí)忘了加溴化乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是 PCR 失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看 OD 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條

10、引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做 PCR 有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物使用過(guò)程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì) PCR 擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低 PCR 擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使 PCR 擴(kuò)增失

11、敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增采用的體積為20μl、30μl、50μl 或100μl，應(yīng)用多大體積進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μl 后，再做大體積時(shí)，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。物理原因：溫度對(duì) PCR 擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要。如果變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過(guò)高，影響引物與模板的結(jié)合而降低

12、 PCR 擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下 PCR儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR 失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其 PCR 擴(kuò)增是不會(huì)成功的。2．假陽(yáng)性引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

13、需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，