轉(zhuǎn)pgh基因蠶構(gòu)建研究及轉(zhuǎn)gfp和neo39;r蠶的繼代分析

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)PGH基因蠶構(gòu)建研究及轉(zhuǎn)GFP和neo蠶的繼代分析姓名：魏玲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)指導(dǎo)教師：周澤揚(yáng);夏慶友2002.4.1從G 0 代各蛾區(qū)隨機(jī)取十頭蠶混合提取D N A ，以其作為模板經(jīng)引物特異擴(kuò)增導(dǎo)入的P G H基因( 1 4 6 0 b p ) ，以一定幾率( 轉(zhuǎn)p F b P G H 蠶為2 0 ％，轉(zhuǎn)p S M T P G H 蠶為2 0 ％) 得到預(yù)期大小陽(yáng)性片段，從而篩選到陽(yáng)性區(qū)

2、。2 ．2 ．2 轉(zhuǎn)p F b P G H 蠶和轉(zhuǎn)p S M T P G H 蠶G o 代S o u t h e r n 檢測(cè)為了排除P C R 假陽(yáng)性的影響， 分別以十頭蠶G 0 代P C R 陽(yáng)性個(gè)體O N A 各1 5 pg ，H i n d l l l 酶切后1 ％瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜，以S m a I 酶切質(zhì)粒p S M T P G H 后的小片段( 約1 5 0 0 b p ) 作為探針用片段，經(jīng)地高辛標(biāo)記后，進(jìn)行S

3、 o u t h e r n 雜交，均得到陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)親代有陽(yáng)性的卵圈保留繼代。2 ．2 ．3 轉(zhuǎn)p F b P G H 蠶和轉(zhuǎn)p S M T P G H 蠶G O 代N o r t h e r n 檢測(cè)為了分析P G H 基因在轉(zhuǎn)基因蠶中的轉(zhuǎn)錄情況，每一蛾區(qū)取十頭蠶提取總R N A ( 見(jiàn)圖lI ) ，取1 0 —2 0 ugR N A ，甲醛變性膠電泳后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜?；厥誗 m a l 酶切質(zhì)粒p S M T P G H后的小片段

4、( 約1 5 0 0 b p ) 作探針用片段，經(jīng)地高辛標(biāo)記后進(jìn)行N o r t h e r n 雜交，但未篩選到N o r t h e r n 雜交陽(yáng)性區(qū)。這種結(jié)果的出現(xiàn)可能是由以下幾個(gè)因素造成的：①可能是取材方面的問(wèn)題，由于是隨機(jī)取材．故很有可能出現(xiàn)所取的材料經(jīng)P C R 或S o u t h e r n 檢測(cè)就無(wú)陽(yáng)性個(gè)體存在，因此在以后的實(shí)驗(yàn)中可以考慮在蠶幼蟲(chóng)期第五齡的時(shí)候，從蠶體抽取部分血液作P C R 檢測(cè)，進(jìn)行初步篩選，然后

5、再取一部分陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行N o r t h e r n 檢測(cè)和W e s t e r n 檢測(cè)，從而判斷該轉(zhuǎn)基因蠶是否轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。②在N o r t h e r n 雜交過(guò)程中，m R N A 可能已被降解，這可通過(guò)蛋白質(zhì)檢測(cè)( w e s t e r n 檢測(cè)) 驗(yàn)證。3 ．轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因蠶和轉(zhuǎn)新霉素抗性基因蠶的繼代分析利用P C R 技術(shù)對(duì)本室采用精子介導(dǎo)法構(gòu)建的轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因( G F P ) 蠶及基因槍法構(gòu)建的新霉素抗性基