蠶兩種類(lèi)型AChE之間及其與蠶寄生蠅AChE的比較研究.pdf

1、乙酰膽堿酯酶(EC3.1.1.7,AChE),是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,它的主要功能是在神經(jīng)突觸處通過(guò)催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach),調(diào)節(jié)Ach的水平從而終止神經(jīng)沖動(dòng)。AChE是由AChE基因(ace)編碼的,它是有機(jī)磷(OP)和氨基甲酸酯(CB)類(lèi)農(nóng)藥的主要作用靶標(biāo)。人們已經(jīng)從數(shù)十種脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中克隆了AChE的編碼序列。大多數(shù)昆蟲(chóng)的AChE是由兩種AChE基因(ace)編碼的。盡管在基因克隆方面做了大量的工作,但對(duì)兩種AC

2、hE功能的研究較少,兩種AChE的具體生物學(xué)作用仍不明確。本論文主要做了如下研究:
　　 1、不同蠶品種的兩種類(lèi)型ace多態(tài)性及對(duì)農(nóng)藥的敏感性研究
　　 中國(guó)有1000多種家蠶品種種質(zhì)資源,而且家蠶受到的農(nóng)藥污染相對(duì)較少,這為ace多樣性研究提供了好的材料。本研究測(cè)定了有代表性的24個(gè)品種家蠶對(duì)農(nóng)藥毒死蜱和殘殺威的生物活性,比較了這24個(gè)品種家蠶AChE的比活力;克隆了31個(gè)品種家蠶兩種AChE的全長(zhǎng)cDNA序列,對(duì)其氨

3、基酸序列進(jìn)行了突變位點(diǎn)分析,并對(duì)31品種家蠶的核苷酸序列進(jìn)行了進(jìn)化分析。農(nóng)藥生物活性測(cè)定結(jié)果表明,不同家蠶品種對(duì)不同的農(nóng)藥具有不同的敏感性;純化的家蠶AChE的比活力分析表明,不同品種家蠶的AChE具有不同的比活力,酶的比活力和農(nóng)藥敏感性沒(méi)有直接的相關(guān)性。對(duì)31個(gè)品種家蠶的氨基酸突變位點(diǎn)進(jìn)行序列聯(lián)配分析發(fā)現(xiàn),已克隆測(cè)序的31個(gè)1型ace ORF中有63氨基酸點(diǎn)突變,而已克隆的31個(gè)2型ace中僅有13個(gè)氨基酸點(diǎn)突變,由此可知家蠶2型ac

4、e相對(duì)保守。根據(jù)不同品種家蠶的核苷酸序列構(gòu)建了兩種AChE的進(jìn)化樹(shù),結(jié)果表明,兩種AChE在進(jìn)化關(guān)系上是獨(dú)立發(fā)生的。
　　 2、蠶兩種ace在不同發(fā)育階段的差異表達(dá)及RNAi干擾研究
　　 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分析了家蠶蠶卵和幼蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期兩種AChE mRNA表達(dá)水平的變化;通過(guò)RNAi技術(shù),研究了喂食兩種AChE dsRNA對(duì)家蠶AChE mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明,在卵、1齡幼蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)、3齡幼蟲(chóng)

5、時(shí)期,家蠶的2型AChE的表達(dá)水平明顯高于1型AChE,而在4齡和5齡幼蟲(chóng)中,兩種AChE的表達(dá)水平相似;在幼蟲(chóng)期,兩種AChE的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。RNAi研究表明,給家蠶幼蟲(chóng)喂食兩種類(lèi)型AChE基因的dsRNA都能使家蠶幼蟲(chóng)的發(fā)育延遲,最終導(dǎo)致家蠶死亡。Realtime PCR分析表明,RNAi降低了兩種類(lèi)型AChE mRNA的表達(dá)水平。
　　 3、蠶兩種ace克隆及其編碼蛋白的催化特性和抑制動(dòng)力學(xué)比較
　　 在我們

6、已經(jīng)克隆和表達(dá)家蠶兩種類(lèi)型的ace基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步克隆了家蠶的祖先--野蠶的兩種類(lèi)型的ace的全長(zhǎng)cDNA序列;在昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了這兩種ACHE;比較了這兩種AChE的催化特性以及兩種AChE對(duì)OP和CB類(lèi)殺蟲(chóng)劑的敏感性。兩種AChE的底物專(zhuān)一性和對(duì)選擇性抑制劑的敏感性分析表明,兩種重組AChE均具有高度的專(zhuān)一性和較高效的催化活性。酶動(dòng)力學(xué)分析表明,1型AChE對(duì)ATC、BTC、和PTC的水解速率(Vmax)分

7、別是2型AChE的2.78、8.27、1.3倍。殺蟲(chóng)劑抑制動(dòng)力學(xué)分析表明,在9種OP和CB類(lèi)農(nóng)藥中,1型AChE對(duì)其中8種更敏感,但2型對(duì)其中的庚烯磷農(nóng)藥更敏感。通過(guò)序列聯(lián)配分析表明,這些敏感性的差異可能是由于兩種酶的周邊位點(diǎn)差異引起的。兩種AChE的酶學(xué)和抑制劑敏感性差異為設(shè)計(jì)新型的選擇性農(nóng)藥的提供了理論基礎(chǔ)。
　　 4、蠶追寄蠅ace的克隆,抗性相關(guān)點(diǎn)突變分析及其與宿主蠶2種AChE抑制動(dòng)力學(xué)比較
　　 追寄蠅Exo

8、rista sorbillans(Diptera:Tachinidae)是家蠶的重要寄生害蟲(chóng),給蠶業(yè)造成很大損失。滅蠶蠅是一種用來(lái)防治家蠶寄生蠅的OP農(nóng)藥,其選擇性殺滅追寄蠅機(jī)理仍不明確。由于長(zhǎng)期使用,滅蠶蠅等農(nóng)藥已經(jīng)出現(xiàn)抗性問(wèn)題,其抗性機(jī)制也有待解明。本研究首次克隆并表達(dá)了家蠶追寄蠅的ace,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與抗性相關(guān)的點(diǎn)突變(Gly353Ala,對(duì)應(yīng)酶分別縮寫(xiě)為Es-353G-AChE和Es-353A-AChE)。本研究將Es-353G-

9、AChE和Es-353A-AChE基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了高效表達(dá),通過(guò)對(duì)Es-353G-AChE和Es-353A-AChE的抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較,確認(rèn)該位點(diǎn)的突變與農(nóng)藥的敏感性性有關(guān)。同時(shí),將表達(dá)的追寄蠅的AChE與其宿主(家蠶)的兩種類(lèi)型AChE進(jìn)行抑制動(dòng)力學(xué)比較發(fā)現(xiàn),追寄蠅的AChE對(duì)農(nóng)藥更敏感,這為OP農(nóng)藥的選擇性殺滅寄生蠅機(jī)理提供了一種深入的解釋。
　　 5、利用生物反應(yīng)器大量表達(dá)AChE研究
　　

10、 通常,農(nóng)藥檢測(cè)是依托GC,LC,GC-MS或者LC-MS等技術(shù)建立起來(lái)的,其靈敏度較高,但耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、樣品準(zhǔn)備復(fù)雜、需要專(zhuān)業(yè)的儀器支持,因此開(kāi)發(fā)一種快速、高效、成本低的檢測(cè)方法實(shí)屬必要。本研究克隆了家蠅敏感品系的AChE基因,利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了該基因;運(yùn)用生物反應(yīng)器,建立了規(guī)模表達(dá)的方法;通過(guò)過(guò)硫酸銨沉淀,親和層析的方法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,從1L表達(dá)產(chǎn)物中獲得了4.2mg重組蛋白,該重組蛋白的酶活力為118.9