醚磺隆降解菌的分離鑒定、基因組學(xué)分析及其降解特性研究.pdf

1、磺酰脲類除草劑是一類高效、低毒、高選擇性的新型除草劑，被廣泛應(yīng)用于水稻、玉米、小麥、大豆等田間雜草的防控，其用量也呈逐年增加的趨勢。然而其微量的環(huán)境殘留就會對后茬敏感作物產(chǎn)生嚴(yán)重的藥害，引起作物減產(chǎn)，甚至絕收，并且造成了大量“癌癥田”，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如何清除其在環(huán)境中的殘留已成為當(dāng)今的熱點(diǎn)問題。以微生物代謝活動為核心的微生物修復(fù)技術(shù)，因其具有能耗低、效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為治理環(huán)境污染的重要手段之一。
　

2、　本文從規(guī)?；こ陶右簶悠分蟹蛛x得到多株能以醚磺隆(cinosulfuron)為唯一氮源進(jìn)行生長的降解菌株，其中菌株LAM0713和LAM0618降解效率最高。菌株16SrRNA基因的序列對比分析結(jié)果表明，LAM0713和LAM0618均歸屬于庫特氏屬（Kurthia），且與現(xiàn)有Kurthia屬有效發(fā)表菌株的16SrRNA基因序列最高位相似性分別為97.1％和96.9％，初步判斷二者為Kurthia屬的疑似新種。
　　對疑似新種菌

3、株LAM0713和LAM0618進(jìn)行了系統(tǒng)分類學(xué)研究。利用表型特征分析、生理生化指標(biāo)測定、重要細(xì)胞化學(xué)組分分析、16SrRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因組DNAG+Cmol％含量測定等手段，完成了菌株的多相分類鑒定工作，結(jié)果表明，LAM0713和LAM0618兩菌株的16SrRNA基因序列相似性為100％，DNA-DNA雜交率為85.3±1.4％，多項(xiàng)分類鑒定結(jié)果表明，兩株菌屬于庫特氏屬（Kurthia）的一個(gè)新種，為緬懷我國著名土壤微

4、生物學(xué)家陳華癸院士，該新種被命名為Kurthiahuakuiisp.nov.，其模式菌株為LAM0618T(=ACCC06121T=JCM19187T)。
　　采用IlluminaHiseq2000測序平臺測定了Kurthiahuakuii的全基因組序列（GenBank登錄號AYTB00000000）。樣品共產(chǎn)出755Mb數(shù)據(jù)?；跍y序數(shù)據(jù)組裝得到菌株Kurthiahuakuii的基因組大小為3，585，165bp，GC含量39.

5、91％，共25個(gè)scaffold，56個(gè)contig?；蚪M組分分析后發(fā)現(xiàn)，Kurthiahuakuii的基因組含有3，560個(gè)編碼序列(CDs)，總長度為3，050，526bp，平均長度857bp，占基因組全長的85.09％。含有112個(gè)tRNA，33個(gè)rRNA。共有2242個(gè)功能基因的功能得到了預(yù)測，被注釋到21個(gè)COG簇中。KEGG數(shù)據(jù)庫分析工得到138個(gè)代謝圖，其中45個(gè)與異源物質(zhì)代謝有關(guān)，約有169個(gè)CDs參與其中。Kurth

6、iahuakuii的全基因組序列的分析將有助于降解基因鑒定，為進(jìn)一步闡明磺酰脲類除草劑的代謝途徑與機(jī)理奠定基礎(chǔ)。這是迄今為止首次關(guān)于磺酰脲類除草劑降解菌株基因組測序的報(bào)道。
　　利用Kurhiahuakuii全基因組信息分析的結(jié)果，從菌株LAM0713中克隆得到了一個(gè)新的酯酶基因Sue，該基因全長831bp，在GenBank中的登陸號為KJ702613。sue基因與目前已發(fā)表的磺酰脲類除草劑降解酶基因的同源性較低，且具有典型的水解

7、酶超家族特征。利用成功構(gòu)建的pET32a-sue重組質(zhì)粒，在37℃培養(yǎng)時(shí)經(jīng)過1mmol/LIPTG的誘導(dǎo)，成功實(shí)現(xiàn)了重組SUE蛋白的高水平表達(dá)，獲得了一條約32kDa的特異性條帶，其對醚磺隆的降解試驗(yàn)表明，SUE蛋白15min內(nèi)對50mg/L濃度的醚磺隆的降解率達(dá)43.2％。運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)軟件初步分析了SUE蛋白的信號肽和夸膜區(qū)并推測了一級、二級和三級結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果表明SUE蛋白可能為新的可降解醚磺隆的酯酶。
　　利用

8、單因素試驗(yàn)，并結(jié)合響應(yīng)面法對高效醚磺隆降解菌株KurhiahuakuiiLAM0713的最適降解條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明:該菌株在GSM液體培養(yǎng)基中的最適降解條件為31.8℃和pH6.9。在最適條件下，LAM0713在5d時(shí)間里，對50mg/L醚磺隆的降解率達(dá)到92.4％。菌株LAM0713可耐受并降解高達(dá)400mg/L的醚磺隆，同時(shí)對苯磺隆(Tribenuronmethyl)，胺苯磺隆(ethametsulfuronmethyl)，玉

9、嘧磺隆(rimsulfuron)，氯磺隆(chlorsulfuron)和芐嘧磺?。╞ensulfuronmethyl）均有較好的降解效果。運(yùn)用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）檢測菌株LAM0713降解醚磺隆時(shí)產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，獲得了5種中間代謝產(chǎn)物，根據(jù)醚磺隆分子結(jié)構(gòu)特征，推斷了LAM0713降解醚磺隆的可能代謝途徑，LAM0713對醚磺隆的降解主要以磺酰脲橋的水解為主。土壤模擬降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株LAM0713在15d內(nèi)