海港柴油降解菌分離鑒定及其降解酶基因分析.pdf

1、[目的]
　　 從舟山港長期被柴油污染的海域表層海水樣品中，直接富集、篩選、分離、純化可利用柴油烴為唯一碳源的柴油降解細(xì)菌，并對其進行形態(tài)、生理、生化特性等鑒定。以柴油培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，優(yōu)化獲得的高效柴油降解菌株的培養(yǎng)條件，測定其對柴油的降解能力。用分子生物學(xué)方法對柴油降解菌的烷烴羥化酶基因alkB和CYP153A的序列進行克隆和初步分析。
　　 [方法]
　　 (1)菌株的富集、篩選、分離、純化以及形態(tài)、生理、生化

2、特性的鑒定
　　 采用逐漸提高柴油濃度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％)的方法，富集培養(yǎng)五個周期后，用稀釋法和劃線法進一步純化，獲得能在柴油培養(yǎng)基中生長的菌株；參照鑒定手冊對篩選的菌株進行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗、16SrDNA序列分析、系統(tǒng)發(fā)育分析等鑒定。
　　 (2)高效降解柴油菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化及降解能力測定
　　 研究不同溫度、pH、柴油初始濃度和菌種接種濃度時，菌株降解柴油的能力，在優(yōu)化

3、的培養(yǎng)條件下，采用紫外分光光度法和GC-MS法測定菌株的柴降解能力。
　　 (3)菌株中烷烴羥化酶基因alkB和CYP153A克隆
　　 通過GenBank序列比對，用Primer5.0設(shè)計與兩種不同基因保守序列能夠互補的兩對引物(AlkBF/R和CYP153AF/R)，分別以菌株基因組DNA和土著質(zhì)粒為模板進行擴增，通過與pUCm-T載體的連接及轉(zhuǎn)化Ecoli.DH5α進行克隆，對陽性克隆子的序列進行測序，并與已報道的

4、序列進行比對分析。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)菌株的富集、篩選、分離、純化以及生理、生化特性的鑒定
　　 通過馴化，從環(huán)境中分離到一株高效柴油降解菌Acinetobactersp.Y9，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察，生理生化鑒定，16SrDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，確定該菌株屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)，并最接近于威尼斯不動桿菌(Acinetobactervenetianus)，序列相似性為99.8％。

5、r>　　 (2)菌株Acinetobactersp.Y9高效降解柴油的培養(yǎng)條件優(yōu)化及降解能力測定
　　 降解條件的優(yōu)化實驗得出，菌株Acinetobactersp.Y9的最佳降解條件為pH8.0、培養(yǎng)溫度30℃、初始油濃度4％(v/v)和接種菌濃度2％(v/v)。紫外分光光度計法測定Acinetobactersp.Y9對柴油的降解率，第7天為62.08％。用GC-MS方法對菌株Acinetobactersp.Y9進行柴油降解效

6、率定性和定量分析，該菌株7天對柴油總的降解率達到了53.28％，對其中C9～C14的短鏈烷烴總降解率較高，為57.19％，對C15～C22的中鏈烷烴的總降解率為49.69％，具有較好的烷烴降解域。
　　 (3)Acinetobactersp.Y9菌株中烷烴羥化酶基因alkB和CYP153A克隆分析
　　 從Acinetobactersp.Y9的基因組DNA和土著質(zhì)粒上分別得到了alkB和CYP153A片段。測序分析表明，

7、菌株Acinetobactersp.Y9基因組DNA上擴增出547bp的alkB片段，而在質(zhì)粒上擴增出兩種不同的alkB，大小分別是544bp和538bp。菌株Acinetobactersp.Y9基因組DNA和質(zhì)粒上擴增的CYP153A的序列是一樣的，大小為858bp。
　　 [結(jié)論]
　　 從舟山港口海域分離得到的一株高效柴油降解的細(xì)菌Acinetobactersp.Y9，其對柴油7天降解效率達到了62.08％，其基因