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文檔簡(jiǎn)介
1、[目的]
從舟山港長(zhǎng)期被柴油污染的海域表層海水樣品中,直接富集、篩選、分離、純化可利用柴油烴為唯一碳源的柴油降解細(xì)菌,并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)、生理、生化特性等鑒定。以柴油培養(yǎng)基為基礎(chǔ),優(yōu)化獲得的高效柴油降解菌株的培養(yǎng)條件,測(cè)定其對(duì)柴油的降解能力。用分子生物學(xué)方法對(duì)柴油降解菌的烷烴羥化酶基因alkB和CYP153A的序列進(jìn)行克隆和初步分析。
[方法]
(1)菌株的富集、篩選、分離、純化以及形態(tài)、生理、生化
2、特性的鑒定
采用逐漸提高柴油濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)的方法,富集培養(yǎng)五個(gè)周期后,用稀釋法和劃線法進(jìn)一步純化,獲得能在柴油培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株;參照鑒定手冊(cè)對(duì)篩選的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、16SrDNA序列分析、系統(tǒng)發(fā)育分析等鑒定。
(2)高效降解柴油菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化及降解能力測(cè)定
研究不同溫度、pH、柴油初始濃度和菌種接種濃度時(shí),菌株降解柴油的能力,在優(yōu)化
3、的培養(yǎng)條件下,采用紫外分光光度法和GC-MS法測(cè)定菌株的柴降解能力。
(3)菌株中烷烴羥化酶基因alkB和CYP153A克隆
通過(guò)GenBank序列比對(duì),用Primer5.0設(shè)計(jì)與兩種不同基因保守序列能夠互補(bǔ)的兩對(duì)引物(AlkBF/R和CYP153AF/R),分別以菌株基因組DNA和土著質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)與pUCm-T載體的連接及轉(zhuǎn)化Ecoli.DH5α進(jìn)行克隆,對(duì)陽(yáng)性克隆子的序列進(jìn)行測(cè)序,并與已報(bào)道的
4、序列進(jìn)行比對(duì)分析。
[結(jié)果]
(1)菌株的富集、篩選、分離、純化以及生理、生化特性的鑒定
通過(guò)馴化,從環(huán)境中分離到一株高效柴油降解菌Acinetobactersp.Y9,經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察,生理生化鑒定,16SrDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析,確定該菌株屬于不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),并最接近于威尼斯不動(dòng)桿菌(Acinetobactervenetianus),序列相似性為99.8%。
5、r> (2)菌株Acinetobactersp.Y9高效降解柴油的培養(yǎng)條件優(yōu)化及降解能力測(cè)定
降解條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出,菌株Acinetobactersp.Y9的最佳降解條件為pH8.0、培養(yǎng)溫度30℃、初始油濃度4%(v/v)和接種菌濃度2%(v/v)。紫外分光光度計(jì)法測(cè)定Acinetobactersp.Y9對(duì)柴油的降解率,第7天為62.08%。用GC-MS方法對(duì)菌株Acinetobactersp.Y9進(jìn)行柴油降解效
6、率定性和定量分析,該菌株7天對(duì)柴油總的降解率達(dá)到了53.28%,對(duì)其中C9~C14的短鏈烷烴總降解率較高,為57.19%,對(duì)C15~C22的中鏈烷烴的總降解率為49.69%,具有較好的烷烴降解域。
(3)Acinetobactersp.Y9菌株中烷烴羥化酶基因alkB和CYP153A克隆分析
從Acinetobactersp.Y9的基因組DNA和土著質(zhì)粒上分別得到了alkB和CYP153A片段。測(cè)序分析表明,
7、菌株Acinetobactersp.Y9基因組DNA上擴(kuò)增出547bp的alkB片段,而在質(zhì)粒上擴(kuò)增出兩種不同的alkB,大小分別是544bp和538bp。菌株Acinetobactersp.Y9基因組DNA和質(zhì)粒上擴(kuò)增的CYP153A的序列是一樣的,大小為858bp。
[結(jié)論]
從舟山港口海域分離得到的一株高效柴油降解的細(xì)菌Acinetobactersp.Y9,其對(duì)柴油7天降解效率達(dá)到了62.08%,其基因
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