抗?jié)h灘病毒囊膜糖蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及G2在畢赤酵母中的表達(dá)鑒定.pdf

1、腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由漢坦病毒（Hantanvirus，HV）引起的一種急性病毒性傳染病，臨床上以發(fā)熱、出血、腎功能損害和免疫功能紊亂為突出表現(xiàn)。我國(guó)是世界上HFRS 疫情最嚴(yán)重的國(guó)家，流行地區(qū)廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率較高，防治任務(wù)十分艱巨。 HV屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）漢坦病毒屬。目前可將HV 分為十種血清型或二十幾種基因型，

2、其中常見(jiàn)的對(duì)人類(lèi)造成危害比較嚴(yán)重的型別有：漢灘病毒（HTNV）、漢城病毒（SEOV）、普馬拉病毒（PUUV）、辛若柏病毒（SNV）等。 以往國(guó)內(nèi)外的大量研究工作表明，HV的M基因編碼的囊膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，HV的中和抗原表位主要分布在GP上，特別是G2上。GP可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對(duì)感染動(dòng)物和人體均具有保護(hù)作用。此外，GP還具有血凝活性、細(xì)胞融合活性及受體結(jié)合活性，因此GP被認(rèn)為是一種重

3、要的保護(hù)性抗原，是漢坦病毒基因工程疫苗的主要候選成份。 但是，該蛋白免疫原性較弱，已有的抗GP的抗體親和（結(jié)合）活性均不高，并且在目前應(yīng)用比較廣泛的幾種表達(dá)系統(tǒng)中，GP表達(dá)水平亦不理想。因此也尚未建立針對(duì)GP的有效的檢測(cè)方法，這些都使得對(duì)GP的研究受到了很大的限制。 本研究根據(jù)GP 上既有中和活性位點(diǎn)又有血凝活性位點(diǎn)的特點(diǎn)，利用HTNV 76-118 株血凝素免疫小鼠制備單克隆抗體（mAb），并以含有G1、G2編碼基因的

4、真核載體G1-pDisplay、G2-pDisplay 轉(zhuǎn)染的CHO 細(xì)胞篩選抗G1和G2 的特異性mAb，對(duì)這些mAb 的免疫學(xué)特性進(jìn)行了初步鑒定；同時(shí)將編碼HTNV 76-118 株G2 的基因片段分別克隆入畢赤酵母胞內(nèi)型表達(dá)載體pPIC3.5K 和分泌型表達(dá)載體pPICZαA，轉(zhuǎn)化酵母工程菌株，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。 1．抗HTNV G1、G2 mAb 的制備及鑒定 以蔗糖-丙酮法從HTNV 76-118

5、 株感染的乳鼠腦中提取血凝素，以此血凝素免疫BLAB/c 小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 融合，以血凝抑制試驗(yàn)（HIA）進(jìn)行篩選，獲得了4 株能穩(wěn)定分泌抗HTNV 血凝素mAb 的雜交瘤細(xì)胞系，分別命名為1A6、1G12、2B2 和2H5。 用分別含有編碼HTNV G1 和G2 基因的真核表達(dá)載體G1-Display、G2-Display 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞，并用此轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)上述4 株mAb。結(jié)果表明，mAb

6、 1G12 與G1-Display 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，提示其是G1 特異性的；2B2 和2H5 均與G2-Display 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，提示它們是G2 特異性的；而1A6 則與G1-Display 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞和G2-Display 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞均呈陽(yáng)性反應(yīng)。 采用HIA 檢測(cè)mAb 1A6、1G12、2B2、2H5 腹水的血凝抑制效價(jià)，結(jié)果分別為1∶4000、1∶16000、1∶16000 和1

7、∶8000。中和試驗(yàn)的結(jié)果表明，4株mAb 均有一定的中和活性，最高中和效價(jià)為1∶40。 2．HTNV G2 蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)與鑒定 將HTNV 76-118 株G2 基因片段分別克隆入畢赤酵母胞內(nèi)型載體（pPIC3.5K）和分泌型載體（pPICZαA），構(gòu)建了含有編碼HTNV G2 蛋白基因的表達(dá)載體pPIC3.5k-G2 和pPICZαA-G2，分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌后用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。用SDS-PAGE 和We