l-精氨酸脂質體對慢性低氧高二氧化碳大鼠一氧化氮及其合酶基因表達的影響

1、{旦 墮 理堂 壘壟；f2L ． 精氨酸脂質體對慢性低 氧高二氧化碳大鼠一氧化氦 及其合酶基 因表達的影響黃 虹 ， 龔永生， 范小芳， 毛孫忠， 胡良岡( 溫州醫(yī)學院肺心病研究室 ， 浙 江 溫州 3 2 5 0 2 7 )l 2l摘要 目的： 探討 L精氨酸脂質體( LA r g ) 對慢 性低 氧高二氧 化碳 大鼠一氧化 氮代謝 及 內皮 型一 氧化 氮合酶基 因( e c N O SnN A) 表達的影響。方法將 4 0只健康

2、雄性 S D大鼠隨機分為 4 組 。 正 常對照組 ( N C組) ， 低 氧高二氧化碳 4 周組(組) ， 低氧 高 二氧化碳加 L ～ A r g 4周組 ( H L組 ) 和低 氧高二氧化碳加 LA r g 脂質體 4 周組 (組) 。 采 用硝酸還原酶法測定血漿一氧 化氮代謝產物 ( N G 一 ) 含量 ， 組織 原住雜交、 光鏡和 圖像分析 等方法觀察 肺細小動脈 顯微結構 以及肺細小動脈 e c N O Sm P ~ N

3、A 的表達 變化。結果 ： ① 卜 Ⅱ { 組 m P A P 和 R V ／ ( L V+ S ) 高 于 N C組， 卜 玎 P 組均明顯低 于 H L 組與 卜 Ⅱ { 組 ： ② 組的血漿 N O含 量顯著低于 N C 組 ( P <0 ． 0 1 ) 。 H L組與 卜 玎 P 組均明顯 高于 卜 Ⅱ { 組 ( P < 0 ． 0 1 ) ； ③H 組的肺 細小動脈 e C N O S m R N A的平均 吸

4、光度值低 于 N C組( P<0 ． 0 5 ) ； 而組明顯 高于 Ⅲ 組和 H L 組( P < 0 ． 0 1 ) ； ④卜 玎 P 組的肺細小動脈 管壁 面積／ 管總面積比值( WA ／ T A ) 和 中 膜厚度 ( P A M T ) 均明顯低 于組( P < 0 ． 0 1 ) ， 且低 于 H L組( P <0 、 0 5 ) 。結論 ： L 一脂質體較 L — A r g 有更明顯的降低慢性低

5、 氧高二氧化碳 大鼠肺動脈 壓和減輕肺血管重建的治療作用， 其機制可能與 L — A r g 脂質體促進 L - A r g 的跨膜 轉運 有關。關鍵詞 ： 脂質體 ； L 一 精氨酸 ； 一氧化 氮舍酶； 低氧 ；高碳 酸血；高血壓 。 肺性中圖分類號 ： R 5 4 1 ． 5 ； R 3 6 4 、 4文獻標識碼 ： A文章編號 ： 1 0 0 0 — 6 8 3 4 ( 2 0 0 4 } 0 2 — 0 1 2 1 — 0 4

6、慢性低 氧性肺動脈高壓 ( c h r o n i ch y p o x i cp u l —m o n a r yh y p e r t e n s i o n ， C 卜 ⅡH ) 是肺心病發(fā)生、 發(fā)展過 程中重要的病理生理環(huán)節(jié) ， 其機制 尚未完全 闡明。一 氧化氮( n i t r i co x i d e ， N O ) 是迄今為止發(fā)現(xiàn) 的機體 最強的內皮依賴性舒張因子之一。大量研究表明，N O生成減少在慢性低氧性肺動脈高壓形

7、成中具有 重要作用【 1 ． 2J 。體內 N O的合成取決于血漿與細胞 內 N O的前體 L 一 精氨酸( L — A r g ) 的含量 、 L - A r g 的跨 膜轉運與胞漿 N O合酶( N Os y n t h a s e ， N O S ) 的活 性_ 3J 。以往研究主要集中在 N O S活性改變方面， 且 結果不一致I 4J ， 但對 L - A r g的跨膜轉運在 C H P H中的作用 ， 尚鮮有報道。本研究采用

8、 L ～ A r g 脂質體 法， 探討 L _的跨膜轉運對慢性低氧高二氧化碳 大鼠N O代謝產物 、 e c N O S 基因表達的影響 ， 以便進 一 步研究 N O ／ L - A r g系統(tǒng)在 C H P H發(fā)病機制 中的 作用 ， 為肺動脈高壓的防治提供思路。1 材料與方法 1 ． 1 材料 二級標準雄性 S D大 鼠由本院實驗動物中心提 供 ， 兔抗大鼠多克隆抗體 e c N O S 、 S A B C試劑盒購 自武漢博士德

9、生物工程有限公司 ， L — A r g 、 卵磷脂和膽 固醇均購 自S i g m a 公司 ， 魚精蛋 白( 1 0 g ／ L ) 購 自上 海生物化學制藥廠 ， 其余均為市售分析純試劑。1 ． 2L - A r g 脂質體的制備 采用冰凍熔融法． 6 ] 制備 L ’ A 嚷脂質體。1 ． 3 慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓模型[ 7 】 的 復制及動物處理 雄性 S D大鼠 4 0只， 體重 2 6 0 ~3 5 0 g ，

10、隨機分成 4 組 ( ， z =l o ) ： 正常對照組( N C ) 、 單純低氧高二氧化 碳組( H H) 、 低氧高二氧化碳加 L — A r g 組 ( H L ) 和低 氧高二氧化碳加 L - A r g 脂質體組 ( H P ) 。將后 3組 動物放人常壓低氧高二氧化碳艙 內， 控制艙內吸人 氧氣濃度為 9 ％～1 1 ％， c o e 濃度為 5 ％～6 ％ ( 通 過充人氮氣調節(jié)氧濃度， 利用與艙 內連通 的氫氧化 鈉

11、溶液裝置吸收大鼠代謝產生過多的二氧化碳) ， 每 天 8h ， 每周 6d ， 連續(xù) 4 周 ； 每天低氧前半小時尾靜 脈分別給予生理鹽水 2m l 、 L — A r g2m l ( 2 5 0m g ／k g ) 、 L — A r g 脂質體 2m1 ( 2 5 0m g ／ k g ) 。對照組大鼠 除吸人空氣外， 其他飼養(yǎng)條件與各低氧組相同。1 ． 4 肺動脈壓力和右心室重量比測定 動物飼 養(yǎng)到規(guī) 定時 間后 ， 用戊 巴 比

12、妥鈉 ( 3 5mg ／ k gb w ) 腹腔麻醉。自頸外靜脈插管至肺動脈 ，并行頸總動脈插管 ， 分別連接 Y L - 3 和 Y L 一 4 型壓力 傳感器 ， 輸人 S J 一 4 2型生理記錄儀測取平均肺動脈 壓 m e a np u l m o n a r ya r t e r i a lp r e s s u r e ， m P A P ) 和平均 頸動脈壓( m e a nc a r o t i dp r e s s u

13、 r e ， r e C A P ) 。放血處死 動物， 迅速剪開胸腔取出心肺 ， 右下肺置于 4 ％多聚 * 基金項 目： 溫州市科委資助項 目( 8 2 0 0 1 A 2 4 ) ； 浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生 科學研究基金資助項目( S Y 9 6 0 0 0 5 )收稿 日 期 ： 2 0 0 30 71 4 ； 修回 日 期 ： 2 O o 40 10 2作者簡介：黃 虹( 1 9 7 6) ， 女， 浙江溫州人， 碩士在讀， 主要從

14、事肺心病的雇礎研究。維普資訊 http://www.cqvip.com 旦 墮生堡堂盤查；i動脈高壓及肺血管結構重建的發(fā)生 『 本 內 N O的合 成與血漿和細胞內 N O的前體 I一 A r g的含趕、 胞漿 N O S活性和 I一 A r g的跨膜轉運功能密 切相關。以往對慢性缺氧 N O S活性改變方面的研究較 多 ， 但結果卻頗不一致 ． 5 j ， 提示 N O S活性 的改變 并不是低氧時 N O減少的主要因素。近年關于應用

15、 L - A r g 干預低氧性肺血管結構重構的研究得到越來 越多的重視。L - A r g主要源于細胞外組織 間液 ， 經 細胞膜上蛋白氨基酸轉運體( C A T - l ， C A T - 2 ) 進人 細胞內， 貯存于 L - A r g池， 在胞漿和質膜 N O S 作用 下， 生成 N O。在正 常情況下 ， 肺動脈可利用 的 L A r g 來源充足 ， 但 缺氧時肺動脈 內皮損傷， N O S蛋 白 生成減 少， L -

16、A r g成為合 成 N O 的限速因子 8J 。我們先前的工作表明慢性低氧大鼠存在肺血管 L 一精氨酸的轉運障礙 9 ] 。故在治療慢性肺動脈高壓 時補充底物 L - A r g和誘導 N O S活性恐不是最佳切 人點， 因此本實驗利用脂質體( 1 i p o s o m e ) 作為藥物輸 送載體的這一特性， 通過制備 L — A r g脂質體觀察其 是否促進 L - A r g的轉運。實驗結果表明， 慢性低氧高二氧化碳組大鼠肺

17、 動脈壓力和右心室重量比高于正常對照組( P<0 ． 0 5 ) ， L - A r g 脂質體 組大 鼠的肺 動脈壓力 明顯低 于慢性低氧比高二氧化碳組( P<0 ． 0 1 ) ， 而單純 L —A r g 組大鼠的肺動脈壓力與慢性低氧高二氧化碳組 無明顯差異， 提示 L - A r g 脂質體較 L — P u g 有明顯 的 降低慢性低氧高二氧化碳性肺動脈高壓的作用。光 鏡下顯示 L - A r g 脂質體組可明顯抑

18、制由慢性低氧高 二氧化碳引起 的肺細小動脈管壁面積／ 管總面積 比 值( wA ／ ， I 、 A ) 和肺細小動脈中膜厚度( PT) 的增 加， 提示 L ． A r g 脂質體較 L — A r g 有明顯的抑制慢性 低氧高二氧化碳大鼠的肺血管結構重建作用。同時 ， 本實驗發(fā)現(xiàn)慢性低氧高二氧化碳肺動脈 高壓時， 肺 血管 e c N O Sm R N A表達水平 明顯 下降 ，血漿 N O含量明顯減少， 這與國內外較多的研究 結 果

19、相一致 2J 。而與單純 L ． A r g 相 比， 應用 L — A r g 脂 質體使慢性低氧高二氧化碳大鼠肺動脈 內皮細胞內e c N O S 基因表達明顯增強 ， 從而增加血漿 N O含量 。我們 的實驗結果顯示低氧使 N O合成及釋放減 少， 其機制可能與低氧通過損害 內皮細胞的分泌功 能， 引起 L — A r g 代謝產生 N O的催化酶功能低下， 同時低氧使細胞膜電位去極 化， 從而導致 L ． A r g 蛋 白氨

20、基酸轉運載體數(shù) 目減少或／ 和載體酶活性下降川) j有關。說明缺氧削弱內皮依賴性舒張反應與缺氧時 可利用 的 內源性 L — A r g相對或絕 對減 少， 應用 L —A r g 脂質體可能通過促進 L - A r g 轉運 ， 使胞 內 L — A r g含量增加 ， 改善缺氧時 N O合 成限速 因素增加 N O合成 ， 增強血管 內皮細胞 e c N O S基 因表達 ， 部分抵 消低 氧損害 內皮細胞所致 N O合成下 降效應

21、， 提示 L — A r g 脂質體可能為 C H IH的防治提供新 的思路。4 參考文獻 [ 1 】 D uB ， Q iJG， Z h a oB ， e ta 1 ． N i t r i co x i d es y n t h a s ee x —p r e s s i o na n dl o c a l i z a t i o ni np u l mo n a r ya r t e r yo fh y p o x i cp u l

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