庫德畢赤酵母重金屬積累特性及高鹽-低pH下鎘抗性提高機(jī)理研究.pdf

1、水環(huán)境中重金屬污染導(dǎo)致水產(chǎn)品中重金屬超標(biāo)問題時有發(fā)生，嚴(yán)重影響人體健康。微生物對重金屬的生物積累作用是目前重金屬脫除研究的熱點之一，活性微生物具有在復(fù)雜食品物料體系如液態(tài)水產(chǎn)制品中脫除重金屬的能力。良好的重金屬抗性和積累特性是應(yīng)用該方法的必要前提，是活性微生物脫除重金屬的重要保障。本文系統(tǒng)研究了多抗性庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii A16）的重金屬（鎘、銅和鋅）抗性、積累特性和脫除能力，研究了高鹽或低pH對P.ku

2、driavzeviiA16重金屬抗性、積累特性和脫除能力的影響，并對高鹽或低pH條件下P.kudriavzeviiA16鎘抗性提高機(jī)理進(jìn)行了深入的探討。
　　1.以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CICC1211）為對照菌株，系統(tǒng)研究了P.kudriavzeviiA16的重金屬（鎘、銅和鋅）抗性、積累特性和脫除能力。結(jié)果表明，P.kudriavzevii A16具有很高的鎘、銅和鋅抗性與積累特性，并且對

3、鎘和鋅具有很強(qiáng)的脫除能力，對于低于0.04 mmol/L的鎘和0.1 mmol/L鋅的脫除率均超過95％。這兩株酵母對某一種重金屬的積累作用明顯受到其它重金屬離子的影響，銅和鋅離子顯著降低兩株酵母的單位菌體鎘積累量，鎘和鋅離子明顯提高兩株酵母的單位菌體銅積累量，P.kudriavzeviiA16的單位菌體鋅積累量在鎘和銅離子作用下顯著下降，而S.cerevisiae CICC1211的卻有所提高。在相同積累時間、初始重金屬濃度和初始菌體

4、濃度或其它重金屬離子存在的條件下，P.kudriavzeviiA16的重金屬脫除能力均顯著高于S.cerevisiae CICC1211。
　　2.為了明確高鹽或低pH條件下活性P.kudriavzevii A16在重金屬（鎘、銅和鋅）脫除上的應(yīng)用潛力，以S.cerevisiae CICC1211為對照菌株，分別系統(tǒng)研究了高鹽或低pH對P.kudriavzevii A16重金屬抗性、積累特性和脫除能力的影響。結(jié)果表明，高鹽或低pH

5、顯著提高兩株酵母的鎘抗性，這可能與單位菌體鎘積累量特別是細(xì)胞內(nèi)鎘積累量的顯著下降有很大關(guān)系。與對鎘抗性的影響完全不同，高鹽或低pH條件下兩株酵母的銅抗性顯著下降，單位菌體銅積累量特別是細(xì)胞內(nèi)銅積累量的顯著上升對其銅抗性的下降可能有很大影響。兩株酵母的鋅抗性無顯著變化，然而兩株酵母的單位菌體鋅積累量均有所提高。與對S.cerevisiaeCICC1211的影響不同，高鹽或低pH并沒有明顯降低活性P.kudriavzeviiA16的鎘、銅和

6、鋅脫除能力，反而在某些條件下提高了其脫除能力。在高鹽或低pH下，P.kudriavzevii A16對鎘、銅和鋅的脫除能力均顯著高于S.cerevisiae CICC1211。
　　3.采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究高鹽或低pH下P.kudriavzeviiA16的鎘抗性提高機(jī)理。運用RNA-Seq結(jié)合de novo組裝技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平上研究高鹽-鎘脅迫與鎘脅迫、低pH-鎘脅迫與鎘脅迫等條件下P.kudriavzeviiA16的基因表達(dá)差異

7、，選擇FPKM值為4倍差異變化且FDR＜0.001的轉(zhuǎn)錄本作為差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋和分析。高鹽-鎘脅迫與鎘脅迫之間共篩選出差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本62個:涉及抗氧化活性、應(yīng)激反應(yīng)、甘油運輸、電子傳遞等功能的23個轉(zhuǎn)錄本在高鹽-鎘脅迫中表達(dá)量上調(diào)，而涉及跨膜運輸、核糖體生物合成、轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能、細(xì)胞壁合成等功能的39個轉(zhuǎn)錄本在高鹽-鎘脅迫中表達(dá)量下調(diào)。低pH-鎘脅迫與鎘脅迫之間共篩選出的61個差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本:涉及應(yīng)激反應(yīng)、甘油運輸、電子傳遞、抗

8、氧化活性等功能的32個轉(zhuǎn)錄本在低pH-鎘脅迫中表達(dá)量上調(diào)，而涉及跨膜運輸、核糖體生物合成、轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能、細(xì)胞壁合成等功能的29個轉(zhuǎn)錄本在低pH-鎘脅迫中表達(dá)量下調(diào)。
　　4.運用雙向凝膠電泳(2-DE)研究高鹽或低pH對鎘脅迫下P.kudriavzeviiA16蛋白質(zhì)組的影響。對比各組每個蛋白點的豐度，選擇2倍差異變化的蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和功能分析。高鹽-鎘脅迫與鎘脅迫之間共鑒定出差異表達(dá)蛋白點39個:涉及物質(zhì)代謝和能量生成、核糖

9、體合成與轉(zhuǎn)錄、抗氧化活性等功能的28個蛋白點在高鹽-鎘脅迫中表達(dá)量上調(diào)，而涉及物質(zhì)代謝、跨膜運輸?shù)裙δ艿?1個蛋白點在高鹽-鎘脅迫中表達(dá)量下調(diào)。低pH-鎘脅迫與鎘脅迫共鑒定出差異表達(dá)蛋白點21個:涉及物質(zhì)代謝、抗氧化活性等功能的11個蛋白點在低pH-鎘脅迫中表達(dá)量上調(diào)，而涉及物質(zhì)代謝、跨膜運輸?shù)裙δ艿?0個蛋白點在低pH-鎘脅迫中表達(dá)量下調(diào)。
　　5.運用SYBR Green qRT-PCR技術(shù)對與P.kudriavzevii A

10、16鎘抗性提高相關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鹽或低pH均能顯著提高P.kudriavzeviiA16鎘脅迫下SODC、SODM、PRX1、PRX2D、CATA等抗氧化物酶基因的表達(dá)。抗氧化物酶活力變化與基因表達(dá)的變化一致，高鹽或低pH下P.kudriavzeviiA16的T-SOD、POD和CAT活力均明顯高于單獨鎘脅迫下的活力?？寡趸锩富虻拇罅勘磉_(dá)在降低鎘脅迫下P.kudriavzevii A16細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞死

11、亡率、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平、蛋白質(zhì)氧化損傷水平等方面發(fā)揮了很大作用，是P.kudriavzeviiA16鎘抗性提高的重要原因。此外，高鹽或低pH均能顯著提高鎘脅迫下P.kudriavzeviiA16中YCF1、GST、HSP12、RAD57等基因的表達(dá)，而這些基因的大量表達(dá)對于降低鎘毒性、降低氧化脅迫、維持細(xì)胞穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用。
　　重金屬污染是水產(chǎn)品中最為嚴(yán)重的安全問題之一，目前還沒有很成熟的方法用于解決水產(chǎn)品中重金屬超標(biāo)問題