固定化GABA受體及固定化大鼠小腸組織的電化學(xué)生物傳感器的研究.pdf

1、睡眠問題影響著現(xiàn)代人的健康，透支著人們的身體，成為許多疾病的誘因，以及成為高血壓、糖尿病以及青少年智力發(fā)育的重要影響因素，因此解決當(dāng)代人的睡眠問題是解決許多其他疾病的關(guān)鍵所在，解決睡眠問題迫在眉睫?，F(xiàn)在臨床上使用的安眠類藥物一般是安眠類西藥，如地西泮、巴氯芬等。但是此類藥物只能在短期內(nèi)解決睡眠，長期用藥會(huì)造成耐藥性和誘發(fā)其他不良反應(yīng)，因此尋找安全有效的替代類藥品解決問題的根源所在。
　　酸棗仁是一種具有安眠鎮(zhèn)靜作用的傳統(tǒng)中藥，在著

2、名古籍《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》中都早有記載。現(xiàn)代研究表明：酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B是酸棗仁中主要起作用的物質(zhì)，其中以酸棗仁皂苷A含量最多，也是安眠鎮(zhèn)靜的主要活性成分。電化學(xué)生物傳感器是一種利用電化學(xué)作為換能器，利用生物活性元件作為敏感元件的精致測量儀器?；诖耍狙芯坷脙煞N不同的生物學(xué)元件—GABABR1a受體和大鼠的小腸組織制作兩種不同電化學(xué)生物傳感器，均對酸棗仁皂苷A與其受體GABABR1a的作用進(jìn)行檢測。
　　取成年

3、SD大鼠小腸組織，清洗干凈并將整段的小腸進(jìn)行分段，取空腸段中間的一小段，然后將其制成面積約為0.25 cm2的單層膜，使用淀粉-海藻酸鈉為固定劑，將該測定膜固定在兩張核微孔膜，最后在固定在中間玻碳電極表面制成“三明治”結(jié)構(gòu)的測定膜，此為本研究所使用的生物敏感元件。該組裝過程每一步都使用循環(huán)伏安法進(jìn)行表征。然后利用電化學(xué)工作站，將組裝好的電極用時(shí)間電流法對不同濃度的酸棗仁皂苷A溶液進(jìn)行定量化檢測。
　　結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)小腸組

4、織與酸棗仁皂苷A呈現(xiàn)雙曲線，使用雙曲線模型進(jìn)行回歸擬合，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.98615；經(jīng)過分析，使用雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk方程）作圖并進(jìn)行回歸分析，R2為0.99002，并進(jìn)一步計(jì)算得出受體-配基相互作用激活常數(shù)為5.0035×10-16mol/L。通過與裸電極相比，進(jìn)一步推導(dǎo)分析計(jì)算得出信號(hào)放大倍數(shù)為108倍，以及計(jì)算得出小腸細(xì)胞上GABA受體的個(gè)數(shù)約為5個(gè)。使用該同一只傳感器對同一樣品測定10次，R.S.D為4

5、.98％，對不同批次的該傳感器5支進(jìn)行測定，R.S.D為2.346%，說明該傳感器的重現(xiàn)性良好；電極保存在4℃的PBS上方，第3天時(shí)為最初響應(yīng)信號(hào)的89.47%，第7天時(shí)為84.79%，說明該傳感器穩(wěn)定性良好。
　　通過NCBI查找GABA受體基因GABABR1a，利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1獲得重組質(zhì)粒，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至HEK-239T細(xì)胞，利用HEK-239T細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)表達(dá)獲得目的蛋白，至此獲得本研究所需要的

6、第一種生物活性物質(zhì)。然后利用自組裝等方法，在玻碳電極表面依次固定殼聚糖、納米金溶膠、GABABR1a蛋白溶液、硫堇-殼聚糖混合物、辣根過氧化物酶-納米金溶膠、GABABR1a蛋白溶液，最后用牛血清白蛋白封閉。該組裝過程每一步都使用循環(huán)伏安法進(jìn)行表征。然后使用電化學(xué)工作站，將組裝好的電極用時(shí)間-電流法對不同濃度的酸棗仁皂苷A溶液進(jìn)行定量化檢測。結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)GABABR1a與酸棗仁皂苷A呈現(xiàn)雙曲線，使用雙曲線模型進(jìn)行回歸擬合，相

7、關(guān)系數(shù)（R2）為0.97435；使用雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk方程）作圖并進(jìn)行回歸分析，R2為0.96416，并進(jìn)一步計(jì)算得出受體-配基相互作用激活常數(shù)為4.758×10-15mol/L。說明該傳感器在一定程度上可以模擬體內(nèi)的信號(hào)傳遞過程，揭示了受體與配體相互作用的關(guān)系。使用該同一只傳感器對同一樣品測定10次，R.S.D為5.86%，對不同批次的該傳感器5支進(jìn)行測定，R.S.D為1.723%，說明該傳感器的重現(xiàn)性良好；電極

8、保存在4℃的PBS上方，第3天時(shí)為最初響應(yīng)信號(hào)的92.54%，第7天時(shí)為88.79%，說明該傳感器穩(wěn)定性良好。
　　通過上述兩種不同的電化學(xué)生物傳感器的研究，我們既在分子層面討論了酸棗仁皂苷A與GABA受體的作用關(guān)系，又在組織層面揭示了小腸組織與酸棗仁皂苷A的相互作用。這對于酸棗仁皂苷A的藥物評(píng)價(jià)以及G蛋白偶聯(lián)受體藥物的開發(fā)和篩選提供了一定的參考意義。同時(shí)該研究也提出了一種新的研究細(xì)胞信號(hào)傳遞的思路，揭示了細(xì)胞的信號(hào)放大倍數(shù)和細(xì)胞