磁性納米載體的制備及在酶固定化中的應(yīng)用.pdf

1、由于具備超順磁性、生物兼容性和低毒性，磁性Fe3O4納米材料已成功應(yīng)用于藥物輸送系統(tǒng)，高熱治療癌癥，磁共振成像（MRI）造影劑，金屬和有機(jī)材料的分離，通過與不同有機(jī)物復(fù)合可得到兼具無機(jī)納米粒子和有機(jī)物性質(zhì)磁性顆粒。
　　本論文制備了兩種磁性復(fù)合載體Fe3O4@chitosan和Fe3O4@OA@DP，并考察了脂肪酶在兩種磁性納米載體上的固定化及青霉素酰化酶在磁性Fe3O4@chitosan納米載體上的固定化。
　　論文第二章

2、采用共沉淀法在堿性溶液中共沉淀鐵鹽和殼聚糖，然后經(jīng)高溫處理制備穩(wěn)定的磁性Fe3O4@chitosan納米粒子。透射電鏡觀測的結(jié)果顯示制備的磁性納米粒子呈現(xiàn)核-殼結(jié)構(gòu)的球狀，平均粒徑為25 nm左右。通過傅立葉變換紅外光譜檢測，磁性Fe3O4@chitosan的譜圖中含有氨基和羥基的特征峰，說明殼聚糖成功包覆在磁性Fe3O4納米粒子表面。以此磁性納米顆粒為脂肪酶固定化的載體，通過先物理吸附后化學(xué)共價連接的方法即(CCEE)法，在最佳固定化

3、條件:脂肪酶濃度0.396mg/mL，時間4h，pH5.0，溫度30℃，加入0.1 M EDC時，獲得的磁性固定化脂肪酶酶活力回收率可達(dá)到75％，載體的蛋白吸附量可達(dá)到16.8 mg/g。與游離脂肪酶相比，固定化脂肪酶的最適pH也為9.0，最適反應(yīng)溫度提高了10℃，60℃的半衰期延長了1.5 h，且具有良好的操作穩(wěn)定性，重復(fù)使用十次以后仍保留有70％以上的酶活。最后測定了固定化酶的Km為28.73mM，最大反應(yīng)速度為2.26 mmol/

4、min，分別是游離酶的1.35倍和0.4倍。
　　論文第三章首先采用共沉淀法制備的磁性Fe3O4納米粒子，然后用溶膠-凝膠法在其表面包裹一層油酸，得磁性Fe3O4@OA納米粒子，最后利用多巴胺自聚-氧化作用對復(fù)合載體Fe3O4@OA進(jìn)行表面修飾，制備表面具有大量活性基團(tuán)-醌基的載體。透射電鏡下，顆粒呈球狀，粒徑約為15nm，分散性良好。通過傅立葉變換紅外光譜儀檢測，載體表面的油酸的特征峰被改變，說明多巴胺通過與油酸發(fā)生反應(yīng)而包覆在

5、其表面。以磁性Fe3O4@OA@DP納米粒子為載體，利用聚多巴胺表面醌基與脂肪酶分子中的自由氨基發(fā)生Michael addition和Schiffbase formation反應(yīng)將脂肪酶固定在載體上。實驗確定磁性載體Fe3O4@OA@DP固定化脂肪酶的最佳條件為:脂肪酶濃度0.264mg/mL，時間為10h，pH為7.0，所制得固定化脂肪酶酶載量為13.09 mg/g，固定化效率85.5％。與游離酶相比，固定化酶的最適pH從9.0變?yōu)?

6、.0，最適反應(yīng)溫度沒有變化，均為50℃，固定化酶的熱穩(wěn)定性有較大提高。固定化酶具有優(yōu)異的操作穩(wěn)定性，重復(fù)使用10次后仍保留有70％的活性。游離酶的Km為8.86 mM，Vmax為2.51 mmol/min，固定化脂肪酶的Km為10.5 mM，Vmax為2.13 mmol/min。
　　論文第四章研究了以磁性Fe3O4@chitosan納米粒子為載體，通過雙功能交聯(lián)劑碳二亞胺(EDC)的作用，將青霉素酰化酶固定在磁性載體上，在最適固

7、定化條件:20 mg EDC，pH6.0，0.176 mg/mL酶濃度，25℃，固定化時間40 min時，獲得的固定化酶的蛋白質(zhì)收率為69.2％，活力回收率68.2％。比較了游離酶與固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，固定化酶的最適反應(yīng)pH從9.0升高至10.0，且對pH值的變化較穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度也為45℃，但固定化酶在較大溫度范圍內(nèi)(30-55℃)都保持有75％以上的相對酶活。固定化酶的具有良好的操作穩(wěn)定性，重復(fù)使用十次后仍保留有77.8

8、％的酶活。固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)分別為1.19mM和0.68 mM，表明固定化操作降低了酶與底物的親和力。
　　最后研究了三種固定化酶的催化反應(yīng)，探索固定化酶在工業(yè)應(yīng)用中的可能性。選擇合成維生素C棕櫚酸酯、油酸丁酯和阿莫西林三個反應(yīng)進(jìn)行考察，并研究了合成條件對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。實驗結(jié)果顯示:在異丁醇中，F(xiàn)e3O4@chitosan脂肪酶催化合成維生素C棕櫚酸酯的適宜條件為反應(yīng)時間18h，50℃，維生素C和棕櫚酸的摩爾比為1∶7

9、時，維生素C棕櫚酸酯的產(chǎn)率為58.5％。在環(huán)己烷中，F(xiàn)e3O4@OA@DP脂肪酶催化合成油酸丁酯的最佳條件為油酸與正丁醇的摩爾比為1∶1.2，37℃，反應(yīng)6h，最終轉(zhuǎn)化率為85.93％。在40％的乙二醇中，F(xiàn)e304@chitosan青霉素?；复呋铣砂⒛髁值淖罴褩l件為6-APA與HPGM的摩爾比為2.0，pH6.0，25℃，反應(yīng)14h，合成產(chǎn)率為74.03％。
　　以上結(jié)果表明，磁性納米載體作為固定酶的載體能夠有效的提高酶的