磁性納米顆粒定向固定化脂肪酶及其應(yīng)用研究.pdf

1、磁性納米顆粒具有比表面積大、可均勻分散于反應(yīng)體系、表面易修飾為各種不同活性基團等優(yōu)點,以其為載體固定化的酶在反應(yīng)體系中幾乎不存在傳質(zhì)阻力,且能夠非常容易地在外加磁場作用下分離回收以重復(fù)使用,從而大大降低酶的使用成本。其中磁性納米顆粒共價交聯(lián)固定化酶穩(wěn)定性最佳。但傳統(tǒng)的共價固定化載體多隨機與酶分子上的活性基團共價交聯(lián),這可能導(dǎo)致底物進入酶活性位點的通道被阻塞,或形成多位點結(jié)合,更甚者,當共價結(jié)合位點在酶催化活性中心附近時,會造成酶活性構(gòu)象

2、發(fā)生不可逆的改變,導(dǎo)致酶活大幅降低。為此,本文通過生物信息學(xué)分析獲知酶的結(jié)構(gòu)信息,以此為基礎(chǔ),開發(fā)簡便易行的定向固定化方法。針對不同酶種采用不同固定化體系,并首次使用反膠束固定化體系,獲得了高催化性能的固定化酶。同時也為其它酶種的定向固定化提供有益借鑒。
　　本文以自制Fe3O4磁性納米顆粒(MNPs)為載體,定向固定化解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)脂肪酶LIP2(YLLIP2)和洋蔥伯克霍爾德菌(Burkh

3、olderiacepacia)脂肪酶(BCL),并進行了應(yīng)用探索,主要研究內(nèi)容及結(jié)果摘要如下:
　　1.通過化學(xué)共沉淀法了制備了MNPs,并以(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)包覆其表面,得到帶-NH2功能化的A-MNPs。采用XRD和FT-IR對其進行表征,XRD圖譜證實所得磁性納米顆粒為Fe3O4MNPs,且Fe3O4晶相呈現(xiàn)出反尖晶石型,不含其它雜相,說明制備的磁性納米晶純度極高。FT-IR檢測結(jié)果表明,APTES成功

4、實現(xiàn)了對MNPs的包覆。所制備的磁性納米顆粒MNPs、A-MNPs粒徑分別為17.2nm和18.4nm。
　　2.通過分析YLLIP2和BCL一級結(jié)構(gòu),獲知了兩種酶蛋白的氨基酸組成及帶不同活性基團的氨基酸殘基含量。運用Rasmol軟件進一步分析了兩種酶的三維構(gòu)象,研究酶蛋白中的游離ε-NH2、-COOH、-OH、-SH在其分子上的分布。結(jié)果顯示,兩種酶的游離ε-NH2在酶分子上呈現(xiàn)區(qū)域化分布,距離酶的催化活性中心均較遠,而其它活性

5、基團則相對均一地分布在酶分子上。為此,選擇游離氨基作為共價固定結(jié)合點,以定向固定化YLLIP2和BCL。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合固定化載體性質(zhì),擬定了分別通過酶蛋白上的游離ε-NH2和-COOH為共價結(jié)合點的兩種不同固定化策略,實現(xiàn)酶的固定化。結(jié)果表明:YLLIP2通過酶上游離氨基和羧基固定化,固定化酶蛋白比活力分別為游離酶的36.9％、17.3%;而BCL通過酶上游離氨基和羧基固定化,固定化酶蛋白比活力分別為游離酶的128.2%和94.6%。

6、驗證了生物信息學(xué)分析的結(jié)論。
　　3.確定以游離氨基為共價固定結(jié)合點后,以醛基活化的A-MNPs(G-MNPs)為載體,在水相中共價固定化YLLIP2和BCL,并對其固定化條件進行了單因素優(yōu)化。結(jié)果表明,兩種酶在水相固定化體系中,固定化率均較高,可達85%以上。在最優(yōu)條件下,水相固定化YLLIP2的水解酶活回收率為42.4%;而BCL在固定化體系中存在甘油酯作為激活劑和保護劑的條件下,固定化酶活力得到大幅度提高,其酯化酶活回收率高

7、達1081.9%。
　　4.以G-MNPs為固定化載體,首次在反膠束固定化體系中實現(xiàn)了對YLLIP2和BCL的定向共價固定化。YLLIP2在Span20反膠束體系中定向固定化后,水解酶活回收率可達540.2%。優(yōu)化條件為表面活性劑Span20,W0=1.12,正己醇為助表面活性劑且Z=2.26時,酶活回收率進一步提高到1466.1%。同樣,BCL在AOT反膠束固定化體系,W0=10,正丁醇為助表面活性劑且Z=2時,其酯化酶活回收率

8、可達989.5%。
　　5.研究了固定化YLLIP2和BCL的酶學(xué)性質(zhì)。固定化YLLIP2的最適溫度為30℃,較游離酶提高5℃,最適pH為8.0,與游離酶保持一致;其溫度穩(wěn)定性有了大幅提高,40℃下孵育1小時,固定化YLLIP2的殘余酶活保留61.8%,而游離YLLIP2僅為34.3%;pH穩(wěn)定性也得到大幅增強,pH7.5下孵育1小時,固定化YLLIP2殘余活力為81.5%,而游離YLLIP2僅有36.4%。固定化BCL的最適溫度

9、為45℃,比游離BCL提高5℃,最適pH為7.0,與游離酶一致;其溫度穩(wěn)定性提高顯著,65℃下孵育1小時,固定化BCL的殘余活力高達82.4%,而游離BCL的僅為28.9%;其pH穩(wěn)定性在游離酶擁有的良好耐受性的基礎(chǔ)上又有所提高。
　　6.以固定化YLLIP2為催化劑,催化魚油水解以富集DHA制備功能性油脂。結(jié)果表明,反應(yīng)12h,其水解度及DHA含量達到40.2%和36.8%,相對的游離酶水解度和DHA僅為27.3%和31.6%。