代謝組學(xué)技術(shù)在代謝性疾病及氨基酸檢測方面的應(yīng)用.pdf

1、背景：代謝組學(xué)（metabolomics）作為系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)分支，能夠用于分析生物體內(nèi)的內(nèi)外源性的代謝產(chǎn)物的變化，近年來屢被用于發(fā)現(xiàn)疾病代謝通路的改變，尋找診斷疾病的標(biāo)志物，揭示研究對(duì)象所處的生理和病理狀態(tài)。相關(guān)代謝組學(xué)技術(shù)，例如氣相色譜、液相色譜或色質(zhì)聯(lián)用方法等，也常用于氨基酸、脂質(zhì)等小分子物質(zhì)的檢測。近年來，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver, NAFLD）在世界各國的發(fā)病率不斷提高。雖然該病常合

2、并肥胖、2型糖尿病等代謝綜合征，但是值得注意的是，該病在非肥胖人群中也有較高的發(fā)病率。此病的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，各種診斷手段都有其弊端，且無有效的治療藥物。因此，尋找該病的診斷標(biāo)志物，分析代謝通路的改變，探討其發(fā)病機(jī)制，具有十分重要的意義。
　　目的：⑴基于超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight ma

3、ss spectrometry, UPLC-Q-TOF-MS）研究平臺(tái)，利用非肥胖的NAFLD患者和年齡、體重指數(shù)（Body mass index, BMI）相匹配的健康對(duì)照人群的血清，進(jìn)行非靶標(biāo)的代謝組學(xué)研究，篩選兩組間的差異性代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)可以做為NAFLD另外一種特殊診斷手段的代謝物，探討與疾病相關(guān)的可能的發(fā)病機(jī)制，為該病的治療提供些許思路。⑵利用氣相色譜質(zhì)譜(gas chromatography mass spectrometr

4、y, GC-MS)衍生化法對(duì)生物樣本中的非極性氨基酸進(jìn)行定量檢測；探討疾病組與正常對(duì)照組中非極性氨基酸的差異及其意義。
　　方法：①利用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF-MS）的平臺(tái)，應(yīng)用代謝組學(xué)的方法，結(jié)合現(xiàn)代分析方法，研究NAFLD患者(n=24)和健康對(duì)照組（n=22）之間的內(nèi)源性代謝物發(fā)生的變化。采用軟件MarkerView v1.2.1對(duì)實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和歸一化處理，運(yùn)用Metaboana

5、lyst3.0軟件做主成分分析（Principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal partial least-squares discriminant analysis, OPLS-DA）。根據(jù)SIMCA-P13.0軟件分析中的標(biāo)量投影重要性（Variable importance in projection, VIP）值，結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析中的 P值，對(duì) NAFLD患

6、者和健康對(duì)照人群差異性離子進(jìn)行選擇，并且進(jìn)行鑒定。利用Metaboanalyst3.0軟件對(duì)鑒定出的差異性代謝物質(zhì)進(jìn)行代謝通路的分析，采用受試者工作曲線（Receiver operating characteristic, ROC）對(duì)代謝物的臨床診斷效能進(jìn)行評(píng)價(jià)。②取100μL羊水上清液，加入甲醇去蛋白后提取上層清液吹干，進(jìn)行MSTFA衍生化，利用GC-MS檢測并分析檢測結(jié)果。
　　結(jié)果：⑴非肥胖的NAFLD患者和健康對(duì)照組代謝物

7、的表達(dá)模式，在PCA和 OPLS-DA分析模型中均能很好的區(qū)分開來。在兩組之間鑒定出了17種具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的代謝物，這些物質(zhì)包括類固醇激素及其衍生物，脂肪酸酯，羧酸及其衍生物，苯及其衍生物，尿酸等。與健康對(duì)照組相比，NAFLD患者代謝物水平升高的有：亮氨酸、正亮氨酸，鵝去氧膽酸，?；悄懰?，左旋肉堿，花生四烯酸，脯氨酸，高龍膽酸，尿酸，肌酸酐，7,8-Dehydroastaxanthianthin，羥基丁酸，谷氨酸。比正常對(duì)照組下降的物質(zhì)

8、有棕櫚油酸，棕櫚酰胺，3-苯氧基苯甲酸，甜菜堿。同時(shí)，非肥胖的NAFLD患者的代謝通路亦發(fā)生了異常，這其中包括：丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝通路，花生四烯酸酸代謝通路，精氨酸-脯氨酸代謝通路，谷氨酸鹽代謝通路。⑵該方法具有良好的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度以及回收率。在最優(yōu)化的檢測條件下，被檢測氨基酸最低檢出限為0.12~0.38 mg/L，線性范圍為0.5~10 mg/L，添加回收率在91%~104%之間，日內(nèi)及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在

9、0.84%~9.33%之間。用建立的方法對(duì)17例疾病組和13名正常組孕婦的羊水樣本進(jìn)行測定，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，疾病組孕婦羊水中亮氨酸和異亮氨酸含量顯著降低（P＜0.01），其余3種氨基酸水平無明顯差異。
　　結(jié)論：①利用代謝組學(xué)的研究方法，本研究發(fā)現(xiàn)非肥胖的NALFD患者體內(nèi)存在著多種內(nèi)源性代謝物的改變。本研究獲得的結(jié)果對(duì)于我們深入理解非肥胖NAFLD的發(fā)病機(jī)制有重要的意義。同時(shí)，對(duì)臨床工作者在該病的診斷及治療提供參考依據(jù)。②本方