火腿葡萄球菌產(chǎn)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶條件優(yōu)化及支鏈氨基酸代謝研究.pdf

1、本文研究了來源于火腿的5株葡萄球菌的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(Branched-chain amino acidaminotransferase，BCAT)活性、產(chǎn)酶條件及反應(yīng)體系，測定了BCAT引導(dǎo)下的支鏈氨基酸代謝途徑中支鏈酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶和酯酶活力以及風(fēng)味物質(zhì)，為研究火腿葡萄球菌BCAT酶學(xué)性質(zhì)及其引導(dǎo)的支鏈氨基酸代謝提供理論依據(jù)。研究結(jié)果如下:
　　從火腿中篩選得到5株產(chǎn)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的優(yōu)良葡萄球菌，測定了這些菌株生長曲線

2、和BCAT活力，并以L-亮氨酸為作用底物，對生長快、酶活力高的腐生葡萄球菌RG-2進(jìn)行了產(chǎn)酶條件優(yōu)化，通過單因素和響應(yīng)曲面試驗(yàn)得到優(yōu)化條件為:pH7.09、溫度34.87℃、NaCl濃度為2.21％，在此條件下BCAT活力為38.59±1.58U/mL。
　　羥基乙醇和谷胱甘肽對BCAT活力有促進(jìn)作用，鹽酸羥胺、EDTA及Zn2+、Cu2+等部分金屬離子對酶活有抑制作用(濃度均為1mM)。通過單因素和正交試驗(yàn)得到腐生葡萄球菌RG-

3、2的最優(yōu)反應(yīng)體系為:反應(yīng)溫度37℃、pH8.5、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)濃度為4mM、5'-磷酸吡哆醛(5'-Pyridoxal phosphate，PLP)濃度為0.06mM，在此條件下RG-2的BCAT活力達(dá)到42.69±1.34U/mL。
　　分析了5株葡萄球菌BCAT引導(dǎo)下的支鏈氨基酸代謝途徑中支鏈酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶和酯酶的活力，結(jié)果表明:5株葡萄球菌均有支鏈酮酸脫羧酶活力，其中以腐生葡萄球菌RG-2的酶活最高

4、，達(dá)到36.05±3.42U/mL，木糖葡萄球菌X-6的乙醇脫氫酶活力顯著高于其它菌株(P＜0.05)，達(dá)到88.97±2.91U/mL，腐生葡萄球菌RG-2的酯酶活力顯著高于其它菌株(P＜0.05)，達(dá)到126.67±2.60U/mg蛋白。
　　以L-亮氨酸為底物，在5株葡萄球菌的菌液反應(yīng)體系檢測到產(chǎn)物3-甲基丁醇，其中以RG-2菌液反應(yīng)體系生成的3-甲基丁醇含量顯著高于其它4株葡萄球菌(p＜0.05)，達(dá)到0.088±0.03

5、5mM;在菌株培養(yǎng)前，加入3-甲基丁醛顯著增加3-甲基丁醇的生成量。同時(shí)添加三種支鏈氨基酸(L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸)于酶活反應(yīng)體系時(shí)，只測得亮氨酸的代謝產(chǎn)物3-甲基丁醇，而三種支鏈氨基酸底物分別添加時(shí)，均可測得相應(yīng)的醇代謝產(chǎn)物;三種支鏈氨基酸醇代謝產(chǎn)物的生成量與BCAT底物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異。支鏈氨基酸代謝產(chǎn)物影響條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-甲基丁醇轉(zhuǎn)化率在6-72h范圍內(nèi)隨時(shí)間延長而增大，但差異不顯著(P＞0.05)，且