聚合物或離子液體-檸檬酸鉀雙水相分離純化蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、雙水相萃取技術(shù)（又稱(chēng)水溶液兩相分配技術(shù)）是近年來(lái)出現(xiàn)的、引人注目的、極有前途的分離技術(shù)。它作為一種新型的液-液萃取技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物化工、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文選取了聚乙二醇、咪唑類(lèi)溴鹽/檸檬酸鉀兩種類(lèi)型的雙水相體系研究了蛋白質(zhì)的分離純化。論文的主要工作歸納如下:
　　 1.聚乙二醇(PEG)、咪唑類(lèi)溴鹽離子液體/檸檬酸鉀雙水相相平衡的性質(zhì)研究
　　 用濁點(diǎn)滴定法測(cè)定了聚乙二醇、咪唑類(lèi)溴

2、鹽/檸檬酸鉀兩種類(lèi)型的雙水相體系相圖。結(jié)果表明，各PEG和離子液體的成相能力分別為PEG6000＞PEG4000＞PEG2000＞PEG1000;[C2mim]Br＜[C4mim]Br＜[C6mim]Br。對(duì)于PEG/檸檬酸鉀體系，隨著溫度的升高系線的斜率和長(zhǎng)度逐漸增大;外加中性鹽對(duì)該體系的分相有一定的協(xié)助作用。對(duì)于咪唑類(lèi)溴鹽離子液體/檸檬酸鉀體系，研究發(fā)現(xiàn)在濁點(diǎn)附近體系中檸檬酸鉀的量對(duì)體系的R值和F值影響顯著。本章研究為以后實(shí)驗(yàn)提供了

3、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和必要的理論指導(dǎo)。
　　 2.聚乙二醇/檸檬酸鉀雙水相體系萃取牛血清蛋白的研究
　　 首次采用聚乙二醇(PEG)/檸檬酸鉀雙水相體系實(shí)現(xiàn)牛血清蛋白(BSA)的萃取和反萃取。研究了聚乙二醇分子量(PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000)、聚乙二醇濃度、檸檬酸鉀濃度、牛血清蛋白濃度、體系的pH和體系溫度對(duì)萃取性能的影響。發(fā)現(xiàn)在PEG1000/檸檬酸鉀雙水相體系中，pH對(duì)牛血清蛋白分配的影響顯著

4、。BSA在該雙水相體系中的分配系數(shù)Ka和萃取率Ye隨pH增大而增大。當(dāng)體系的pH和溫度分別為7.0和30℃，體系組成為19％(w/w)PEG1000/20％(w/w)檸檬酸鉀，BSA濃度為0.75mg/g時(shí)，牛血清蛋白在該體系中的萃取率高達(dá)99％。通過(guò)降低體系的pH值，我們實(shí)現(xiàn)了PEG相中牛血清蛋白的反萃取，其反萃取率為92％。反萃取過(guò)程不僅實(shí)現(xiàn)了牛血清蛋白與聚乙二醇的分離，而且能使聚乙二醇得以重復(fù)利用。最終，牛血清蛋白在整個(gè)過(guò)程中的萃

5、取率(Ye+Ybe)為91％。
　　 3.離子液體雙水相體系萃取分離細(xì)胞色素c的熱力學(xué)研究
　　 研究了咪唑類(lèi)離子液體雙水相體系對(duì)細(xì)胞色素c(Cyt-c)的萃取。研究了離子液體陽(yáng)離子的烷基鏈長(zhǎng)度、檸檬酸鉀濃度、溫度、pH等因素對(duì)Cyt-c萃取率的影響。得出了萃取Cyt-c過(guò)程的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)的值（ΔG°T，ΔH°T和ΔS°T）。熱力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)疏水作用和靜電作用是該體系實(shí)現(xiàn)Cyt-c萃取的主導(dǎo)作用力。在最佳條件下，1-己基

6、-3-甲基咪唑溴鹽/檸檬酸鉀雙水相體系將Cyt-c萃取到富含離子液體的上相（萃取率為94％）。從UV-vis和圓二色譜(CD)表征結(jié)果可以看出Cyt-c與離子液體之間沒(méi)有形成化學(xué)鍵并保持了Cyt-c結(jié)構(gòu)特征。與傳統(tǒng)液液萃取技術(shù)（含有大量的揮發(fā)性有機(jī)溶劑）相比，離子液體雙水相萃取技術(shù)占有很大的優(yōu)勢(shì)。
　　 4.利用聚乙二醇(PEG)/檸檬酸鉀雙水相體系從雞蛋清中分離純化溶菌酶的研究
　　 雙水相萃取技術(shù)適用于生物物質(zhì)的分離

7、，具有良好的發(fā)展前景。利用PEG4000/檸檬酸鉀雙水相體系研究了雞蛋清中溶菌酶的分離純化。通過(guò)響應(yīng)曲面法(RSM)，確定了從雞蛋清中提取溶菌酶的最優(yōu)化條件并建立了溶菌酶回收率、純化系數(shù)和活性產(chǎn)率的數(shù)學(xué)模型。部分析因?qū)嶒?yàn)分析結(jié)果顯示，pH對(duì)溶菌酶的回收和純化效果均有較大影響。在pH為5.5、溫度為30℃的條件下，該體系萃取分離溶菌酶的最優(yōu)體系組成為:18％(w/w)PEG4000，16％(w/w)檸檬酸鉀，3.75％(w/w)KCl。在

8、該條件下，純化后溶菌酶的活性、純化系數(shù)和活性產(chǎn)率分別為31100U/mg，21.11和103％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PEG4000/檸檬酸鉀雙水相體系在分離純化溶菌酶的應(yīng)用方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 5.從木瓜蛋白酶制劑中分離純化木瓜蛋白酶的研究
　　 利用聚乙二醇(PEG)/檸檬酸鉀雙水相體系研究了從粗制木瓜蛋白酶制劑中提取木瓜蛋白酶的研究?？疾炝司垡叶挤肿恿?PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG600

9、0)、聚乙二醇的濃度、檸檬酸鉀的濃度、外加中性鹽（氯化鉀）的濃度、pH和溫度等因素對(duì)木瓜蛋白酶純化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示木瓜蛋白酶傾向于分配到雙水相體系中親水性較強(qiáng)的下相（富含鹽的相），且最優(yōu)化體系為PEG4000/檸檬酸鉀體系。在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)響應(yīng)面法建立了關(guān)于木瓜蛋白酶純化的數(shù)學(xué)模型并確定了該體系純化木瓜蛋白酶的最優(yōu)化條件。在pH為5.0、溫度為30℃C的條件下，該體系純化木瓜蛋白酶的最佳體系組成為:PEG4000濃度15％(w/