以克隆蛋白質(zhì)為模板制備分子印跡聚合物用于吸附天然蛋白質(zhì).pdf

1、分子印跡技術(shù)是近二十多年發(fā)展起來的新技術(shù)，印跡聚合物可作為用于生物物質(zhì)的檢測、分析、分離與純化等的基質(zhì)，用于生化免疫和藥物分析、生物大分子的親和分離與純化等領(lǐng)域。從70年代開始，隨著Wulff和Mosbach等人在分子印跡技術(shù)領(lǐng)域的開拓性工作，這一技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。近年來，許多研究者開展了以蛋白質(zhì)為模板的分子印跡聚合物的研究，希望能夠以此作為分離純化蛋白質(zhì)的一種重要手段。但是，由于模板蛋白質(zhì)難以得到等一系列技術(shù)原因，到目前為止，被研究

2、作為模板的蛋白質(zhì)都是一些常規(guī)的，在細(xì)胞中含量很高的蛋白質(zhì)。在高等生命體中，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的含量是非常微小的，一般只占細(xì)胞液中總蛋白量的萬分之幾或者更少，也正是這些微量的蛋白質(zhì)具有著及其重要的生物學(xué)功能。雖然自上個(gè)世紀(jì)八十年代初建立和發(fā)展以來的分子克隆技術(shù)，使得人們可以用分子克隆的手段在大腸桿菌和酵母等低等生命體中表達(dá)高等生命體中的微量蛋白質(zhì)，通過低等生物的大量培養(yǎng)繁衍，得到很大的收獲量。然而盡管克隆蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)十分接近，但

3、仍不是相同的。首先，高等生命體中的許多蛋白質(zhì)含有修飾基團(tuán)，這些基團(tuán)都是在基因表達(dá)蛋白質(zhì)肽鏈合成后由專一的修飾體系完成的。而在低等生命體中不含有這些專一的修飾體系。其次，在大腸桿菌中表達(dá)克隆的蛋白質(zhì)往往帶有多組氨酸短肽或谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的先導(dǎo)肽，這些前導(dǎo)肽雖然在蛋白質(zhì)純化后可以用專一的酶切除，但是總會(huì)有幾個(gè)氨基酸殘基的殘留。而這些結(jié)構(gòu)上的差異帶來的功能上的差別，有時(shí)會(huì)是很大的。因此純化與鑒定這些天然的微量蛋白質(zhì)一直是科學(xué)家們非常感興趣的事情

4、。 本課題正是旨在利用分子印跡技術(shù)，以克隆蛋白質(zhì)為模板，制備一種新型的蛋白質(zhì)分子印跡聚合物，用于從天然細(xì)胞提取物中分離與富集微量的目標(biāo)蛋白質(zhì)。本課題中我們選取作為模板的是在天然細(xì)胞提取物中含量只有0.023％的蛋白質(zhì)豬親環(huán)素18。 首先，我們應(yīng)用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)并水解合成了聚丙烯酸的線性聚合物，通過對其側(cè)鏈進(jìn)行功能基化修飾，就得到了所謂的識(shí)別分子。然后我們又選用pGEX1作為蛋白質(zhì)的載體以分子克隆的手段克隆并在大腸

5、桿菌中大量表達(dá)了豬親環(huán)素18，得到了模板蛋白質(zhì)。我們先把識(shí)別分子與模板蛋白質(zhì)混合，在溶液中進(jìn)行自組裝，然后將組裝體與作為自由單體的丙烯酰胺共同以聚丙烯酸甲酯大孔樹脂為固相載體在水相中進(jìn)行交聯(lián)聚合，洗脫掉模板蛋白質(zhì)之后就得到了蛋白質(zhì)分子印跡聚合物。最后，我們使用該蛋白質(zhì)分子印跡聚合物對天然細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在吸附后的洗脫液中，目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的含量提高了300倍以上。 在本文的最后一章，還介紹了我們選用其

6、它的識(shí)別分子，改變了識(shí)別分子結(jié)構(gòu)及其與蛋白質(zhì)分子相作用的機(jī)理后對蛋白質(zhì)分子印跡聚合物的識(shí)別能力與吸附效果的影響。即制備同時(shí)含有親水支鏈和疏水支鏈的識(shí)別分子，能分別與蛋白質(zhì)中的親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)作用，以此實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的印跡。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)分子印跡聚合物對目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附仍然保持了很高的特異性。 本課題所介紹的分子印跡方法，以克隆蛋白質(zhì)為模板克服了天然微量蛋白質(zhì)的印跡模板難以得到的瓶頸。與傳統(tǒng)的分子印跡方法相比，其印跡過程更相似于