2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離純化的基本流程選擇材料和預(yù)處理細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離蛋白質(zhì)的抽提蛋白質(zhì)的純化濃縮、干燥和保存一、材料的選擇和預(yù)處理微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料,所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮,注意選含量高、來(lái)源豐富及成本低的原料。對(duì)動(dòng)物組織,必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料,先除去結(jié)締組織和脂肪組織。對(duì)預(yù)處理好的材料,若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn),應(yīng)冷凍保存,對(duì)于易分解的生物大分子應(yīng)選

2、用新鮮材料制備。二、細(xì)胞的破碎(一)機(jī)械方法:主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。高速組織搗碎機(jī)(轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm,具高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片),適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織的破碎。玻璃勻漿器(用兩個(gè)磨砂面相互摩擦,將細(xì)胞磨碎),適用于少量材料;也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等,兩面間隔只有十分之幾毫米,對(duì)細(xì)胞破碎程度比高速搗碎機(jī)高,機(jī)械切力對(duì)分子破壞較小。小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取,也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。(二)物理方法:主

3、要通過(guò)各種物理因素的作用,使組織細(xì)胞破碎。反復(fù)凍融法:將細(xì)胞在20度以下冰凍,室溫融解,反復(fù)幾次,由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。超聲波法:用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液,使細(xì)胞急劇震蕩破裂,此法多適用于微生物材料;只要有設(shè)備,該法方便且效果也好,但一次處理量較小。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。(三)化學(xué)及生物化學(xué)法有些動(dòng)物細(xì)胞,例如腫瘤細(xì)胞可采用十

4、二烷基磺酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉等使細(xì)胞膜破壞;細(xì)菌細(xì)胞壁較厚,采用溶菌酶處理效果更好。此外一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞,可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì)胞脹破。細(xì)胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分的材料,或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子,防止其他細(xì)胞組分的干擾,細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離,以便于獲得更好的分離效果。細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法細(xì)胞經(jīng)過(guò)破碎后,在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)

5、量大小不同,沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域,分離后即得所需組分。細(xì)胞器的分離制備,介質(zhì)的選擇現(xiàn)一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖聚乙二醇等溶液。三、蛋白質(zhì)的提取提取是將經(jīng)過(guò)預(yù)處理或破碎了的細(xì)胞或組織置于一定條件下的溶劑中,讓被提取的蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)充分地釋放出來(lái),并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài),不丟失生物活性的過(guò)程。大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數(shù)與脂類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化

6、蛋白質(zhì)。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)鹽析法向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽,在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱(chēng)鹽溶;當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí),蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱(chēng)鹽析。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素溫度:一般室溫操作,對(duì)溫度敏感的蛋白可在低溫下

7、操作。pH:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶解度最低。蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時(shí),欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)(共沉現(xiàn)象)。鹽析中常用的中性鹽:硫酸銨鹽析后除鹽的方法:常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)用緩沖液進(jìn)行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時(shí)間較長(zhǎng),所以最好在低溫中進(jìn)行;也可用葡萄糖凝膠G25或G50過(guò)柱的辦法除鹽,所用的時(shí)間就比較短。等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在表面靜電荷為零狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥

8、力最小,因而溶解度也最小,利用各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差別,可通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀,但此法很少單獨(dú)使用,可與鹽析法結(jié)合用。低溫有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù),從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力,導(dǎo)致溶解度降低;有機(jī)溶劑與水作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜,使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出。常用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮,一般宜在低溫下進(jìn)行,且在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以免局部濃度過(guò)大。(二)蛋白質(zhì)粗品的純化

9、常用的純化方法有:凝膠過(guò)濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等。通常幾種方法聯(lián)合使用來(lái)獲得較高純度的蛋白質(zhì)樣品。凝膠過(guò)濾(分子篩)是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠作分離介質(zhì),根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同對(duì)混合物進(jìn)行分離的技術(shù)。層析柱中的填料是某些惰性的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì),多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類(lèi)物質(zhì),小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部,流下來(lái)速度慢,而大分子物質(zhì)卻被排除在外部,流下來(lái)的速度快,當(dāng)混合物通過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱時(shí),溶液中的物質(zhì)就按不

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