基于GmFT2a和AtD--CGS基因組成型表達(dá)的開(kāi)花期調(diào)控與大豆蛋白品質(zhì)改良.pdf

1、大豆(Glycine max(L) Merr.)是世界上轉(zhuǎn)基因作物品種使用比例最高、種植面積最大的農(nóng)作物。目前全球范圍內(nèi)推廣的轉(zhuǎn)基因大豆以具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因大豆品種為主。如何通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決常規(guī)育種中難以解決的其它重大問(wèn)題，充分發(fā)揮轉(zhuǎn)基因育種優(yōu)勢(shì)是大豆生物技術(shù)育種的重要內(nèi)容。本研究針對(duì)現(xiàn)有大豆品種光溫適應(yīng)范圍狹窄和含硫氨基酸（蛋氨酸和半胱氨酸）缺乏兩大重要問(wèn)題，有針對(duì)性地開(kāi)展分子設(shè)計(jì)育種，探索解決大豆常規(guī)育種中生育期改良性狀導(dǎo)入和

2、背景純化慢以及高蛋氨酸材料遺傳資源限制的問(wèn)題，開(kāi)拓大豆適應(yīng)性改良和蛋白品質(zhì)改良的新途徑。
　　實(shí)驗(yàn)分別選取了大豆開(kāi)花途徑中的關(guān)鍵基因GmFT2a和植物蛋氨酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因—γ-胱硫醚合成酶基因AtD-CGS進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)調(diào)控大豆成花誘導(dǎo)與氨基酸合成兩個(gè)途徑，分別實(shí)現(xiàn)基于大豆花期調(diào)控的大豆廣適性育種以及對(duì)大豆蛋白品質(zhì)的改良，利用所創(chuàng)制的轉(zhuǎn)基因后代材料，對(duì)大豆開(kāi)花調(diào)控的機(jī)制及氨基酸代謝開(kāi)展了相關(guān)研究。
　　在大豆開(kāi)花

3、調(diào)控方面，通過(guò)GmFT2a的過(guò)表達(dá)使晚熟大豆品種自貢冬豆的開(kāi)花期明顯提前。對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)基因后代的開(kāi)花表型及GmFT2a表達(dá)情況分析顯示，轉(zhuǎn)基因材料的早花表型主要是由GmFT2a的表達(dá)水平?jīng)Q定，轉(zhuǎn)基因后代GmFT2a的表達(dá)量與開(kāi)花提前天數(shù)與呈正比，明顯的劑量效應(yīng)。與野生型自貢冬豆相比，開(kāi)花期提前、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期縮短的轉(zhuǎn)基因大豆植株明顯矮化，單株籽粒產(chǎn)量顯著降低。
　　對(duì)不同世代轉(zhuǎn)GmFT2a基因材料開(kāi)花期、成熟期的比較發(fā)現(xiàn)，上述性狀的表型遺

4、傳存在明顯的不穩(wěn)定性?？截悢?shù)分析顯示，GmFT2a高拷貝數(shù)材料的開(kāi)花期晚于單拷貝材料。序列分析表明，在轉(zhuǎn)基因片段結(jié)構(gòu)的外源啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)長(zhǎng)度為129 bp的CpG島，推測(cè)啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度不同導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因后代開(kāi)花期出現(xiàn)差異。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)水平的分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料一樣，GmFT2a的表達(dá)在植株發(fā)育開(kāi)花前處于較低水平，而在后期逐步上調(diào)，可能原因是GmFT2a的表達(dá)在植株發(fā)育前期受轉(zhuǎn)錄后表達(dá)抑制作用的影響。
　

5、　在大豆氨基酸合成代謝方面，重點(diǎn)分析了大豆γ-胱硫醚合成酶基因和蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)化關(guān)系，該基因的保守性暗示其在表達(dá)水平對(duì)反饋抑制具有敏感性。實(shí)驗(yàn)證明，大豆蛋氨酸合成過(guò)程中存在反饋抑制效應(yīng)。在外施蛋氨酸的條件下，大豆內(nèi)源的GmCGS活性顯著降低，限制了蛋氨酸的持續(xù)合成能力。該結(jié)論為通過(guò)表達(dá)量反饋抑制不敏感型AtD-CGS來(lái)提升蛋氨酸含量提供了理論支持。
　　在組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大豆中，AtD-CGS基因可在大豆葉片和籽粒中穩(wěn)定表達(dá)。然而

6、，在部分轉(zhuǎn)基因材料中，出現(xiàn)了植株矮化現(xiàn)象，推測(cè)由AtD-CGS基因的過(guò)量表達(dá)所致。對(duì)轉(zhuǎn)基因材料蛋氨酸含量的檢測(cè)顯示，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因大豆葉片中游離蛋氨酸含量顯著提高，但總蛋氨酸含量與野生型基本一致;轉(zhuǎn)基因大豆籽粒中總蛋氨酸含量顯著提高，而游離蛋氨酸含量的變化因品種而異:在自貢冬豆后代中顯著提高，而吉林小粒1號(hào)未見(jiàn)顯著差異。蛋氨酸積累量的增大導(dǎo)致大豆籽粒蛋白含量的提升。在籽粒蛋白含量顯著提升的部分株系中，脂肪含量顯著下降，說(shuō)明游離蛋氨

7、酸含量的提高可以促進(jìn)大豆蛋白的合成或積累。通過(guò)與實(shí)驗(yàn)室前期種子特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大豆材料以及通過(guò)轉(zhuǎn)化富含蛋氨酸的儲(chǔ)藏蛋白轉(zhuǎn)基因大豆實(shí)例相比較，發(fā)現(xiàn)組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大豆材料可以在更大幅度上提高籽?？偟鞍彼岷?，并同步提升大豆的籽粒儲(chǔ)藏蛋白含量。說(shuō)明游離蛋氨酸含量不足是限制大豆總蛋氨酸積累的瓶頸，而蛋氨酸含量缺乏又是大豆蛋白質(zhì)積累的限制因素。提高游離蛋氨酸合成能力，是獲得高蛋氨酸乃至高蛋白大豆的有效途徑。
　　本研究通過(guò)基因工程手段