紅外和近紅外分光法及其在蛋白分子研究中的應(yīng)用.pdf

1、紅外和近紅外分光法的優(yōu)點(diǎn)在于，能夠直觀地獲取分子振動(dòng)的光譜信息，并且對(duì)任何樣品在任何狀態(tài)下都能檢測(cè)，它們作為無損、快速的分析方法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。為了更好地利用紅外和近紅外光譜研究蛋白分子的結(jié)構(gòu)和特性，人們不斷地提出新的實(shí)驗(yàn)手段和光譜分析方法，但是仍然存在一些難題沒有很好地解決，特別是溶液中蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、水合作用及其動(dòng)力學(xué)過程還有待進(jìn)一步闡明。此外，雖然分子振動(dòng)理論早已完善，但是隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，利用分子振動(dòng)

2、理論與計(jì)算機(jī)輔助相結(jié)合解析分子振動(dòng)狀態(tài)的研究工作也有必要進(jìn)一步完善。 本論文利用紅外和近紅外光與分子相互作用的理論，通過對(duì)加熱導(dǎo)致的溶液中蛋白分子的變性過程的分析，對(duì)溶液中蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、水合作用及其熱動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了詳細(xì)的研究。在研究中，采用了計(jì)算機(jī)輔助分子振動(dòng)分析、光譜解析和光譜實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的手段。首先，利用分子振動(dòng)理論與計(jì)算機(jī)輔助相結(jié)合，系統(tǒng)地研究了分子的振動(dòng)狀態(tài)并總結(jié)了其規(guī)律；其次，在實(shí)驗(yàn)上通過對(duì)溶液中蛋白分子的熱動(dòng)力

3、學(xué)紅外和近紅外光譜的檢測(cè)和解析，研究了蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、水合作用及其熱動(dòng)力學(xué)過程；再次，在參與分光光度計(jì)項(xiàng)目研究的基礎(chǔ)上，對(duì)紅外和近紅外光譜實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行了研究。 在本論文中，所完成的研究工作和取得的研究結(jié)果概要如下：(1)分子振動(dòng)理論方面：①從經(jīng)典和量子力學(xué)理論的角度對(duì)分子振動(dòng)理論進(jìn)行了闡述。②利用分子振動(dòng)理論與計(jì)算機(jī)輔助相結(jié)合研究了不同結(jié)構(gòu)分子的振動(dòng)狀態(tài)，特別模擬了分子的內(nèi)坐標(biāo)力常數(shù)對(duì)分子振動(dòng)基頻的影響，為分子光譜

4、實(shí)驗(yàn)和光譜解析提供了指導(dǎo)。 (2)在紅外分光法對(duì)重水溶液中BSA的研究中，主要利用酰胺Ⅰ譜帶解析了蛋白分子在重水溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其熱動(dòng)力學(xué)過程，不同的分析方法所獲得的結(jié)果為：①二階導(dǎo)數(shù)光譜和曲線擬合用于分離來源于不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的譜帶。在26℃時(shí)，BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有62.54﹪的α-螺旋、29.11﹪的β-鏈、7.76﹪的β-轉(zhuǎn)角以及不含β-片層；在90℃時(shí)，含有18.20﹪的α-螺旋、31.53﹪的β-鏈、25.11﹪的β-轉(zhuǎn)

5、角、19.70﹪的β-片層和5.46﹪的無規(guī)卷曲。結(jié)果表明，在升溫過程中，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化表現(xiàn)為：α-螺旋的減少不僅僅伴隨著β-片層的形成，而且還伴隨著β-轉(zhuǎn)角的增加和無規(guī)卷曲的形成。②相關(guān)性分析和漸進(jìn)因子分析(Evolvingfactoranalyais，EFA)用于解析重水溶液中蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的熱動(dòng)力學(xué)特性。它們的結(jié)果均表明，在升溫過程中，BSA的顯著結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在溫度區(qū)間70-82℃。此外，三因子漸進(jìn)因子分析的結(jié)果顯示，加熱導(dǎo)

6、致的重水溶液中BSA的結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在兩個(gè)溫度區(qū)域——56-70℃和70-82℃，其中56-70℃的結(jié)構(gòu)變化比較微小，僅表現(xiàn)為β-片層的形成，而70-82℃附近的結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)為β-片層和β-轉(zhuǎn)角的增加以及無規(guī)卷曲的形成。③二維相關(guān)光譜用于解析不同二級(jí)結(jié)構(gòu)之間在加熱過程中的相關(guān)性變化。同步相關(guān)光譜的結(jié)果顯示，在加熱過程中α-螺旋與β-片層和β-轉(zhuǎn)角之間有很強(qiáng)的協(xié)同變化，這表明α-螺旋的減少導(dǎo)致了β-片層和β-轉(zhuǎn)角的增加。異步相關(guān)光譜的結(jié)果顯

7、示，在加熱過程中，最早發(fā)生變化的是α-螺旋結(jié)構(gòu)，β-片層結(jié)構(gòu)的變化要早于β-轉(zhuǎn)角、β-鏈、無規(guī)卷曲的變化。 (3)在近紅外分光法對(duì)水溶液中BSA的研究中，7500-5500cm-1和4900-4200cm-1兩個(gè)光譜區(qū)域分別用于研究BSA在溶液中的水合作用和二級(jí)結(jié)構(gòu)，所獲得的結(jié)果為：①水溶液中BSA的溫度相關(guān)差光譜在光譜區(qū)間7200-6600cm-1的光譜強(qiáng)度變化顯示了由于加熱引起的BSA水合作用的變化。BSA水溶液中的水分子可

8、以分為自由水和束縛水兩類，自由水具有與純水相近的結(jié)構(gòu)，而束縛水在加熱過程中會(huì)從蛋白分子的表面移去而成為自由水。水溶液中BSA的水合作用的熱動(dòng)力學(xué)過程變化表現(xiàn)為溶液中束縛水向自由水的轉(zhuǎn)化。②水溶液中BSA的溫度相關(guān)差光譜在光譜區(qū)間4650-4500cm-1的光譜強(qiáng)度變化顯示了由于加熱引起的BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。隨著溫度的升高，4600cm-1附近吸收峰的強(qiáng)度變小并且略向高波數(shù)移動(dòng)，表明BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的減少和氫鍵作用對(duì)NH鍵的影響

9、減小了；在高溫時(shí)，一個(gè)新的肩峰在4530cm-1附近出現(xiàn)，表明BSA二二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成了β-片層，這證實(shí)了4600cm-1附近的譜帶可用于蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)的可能性。③相關(guān)性分析和漸進(jìn)因子分析用于解析水溶液中BSA的結(jié)構(gòu)和水合作用的熱動(dòng)力學(xué)特性。在加熱過程中，BSA水合作用的劇烈變化發(fā)生在73℃附近，而BSA結(jié)構(gòu)的劇烈變化發(fā)生在71℃附近，即水溶液中BSA的結(jié)構(gòu)變化發(fā)生在水合作用之前，換句話說，蛋白分子的顯著水合作用的變化是由于二級(jí)結(jié)構(gòu)

10、的改變引起的。 (4)在紅外和近紅外光譜的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)裝置的研究方面：①對(duì)目前的紅外和近紅外分光光度計(jì)中所使用的光源、檢測(cè)器、分光系統(tǒng)進(jìn)行了歸納和總結(jié)。②針對(duì)光柵色散式的分光光度計(jì)中的光譜級(jí)次重疊問題，提出了一種新的光譜純凈方法，根據(jù)該方法設(shè)計(jì)的濾光片能夠滿足全譜并行測(cè)量的要求，適用于超快速光譜分析的應(yīng)用。③結(jié)合計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，提出了具有遠(yuǎn)程訪問功能分光光度計(jì)的設(shè)想，這一功能已在自主開發(fā)的分光光度計(jì)中得以應(yīng)用，遠(yuǎn)程功能在一定

11、程度上擴(kuò)大了分光光度計(jì)的使用空間范圍。④提出了一種用于溶液樣品和微量液體的近紅外光譜測(cè)量的毛細(xì)管法，通過與采用常規(guī)的近紅外樣品池所獲得的光譜進(jìn)行比較，證實(shí)了毛細(xì)管法的可靠性。毛細(xì)管法具有節(jié)省樣品、便于取樣、不需清洗樣品池等優(yōu)點(diǎn)，這使得它能夠適用于生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用研究。 本論文的研究工作，在計(jì)算機(jī)輔助研究分子振動(dòng)狀態(tài)方面進(jìn)行了有益的探索，對(duì)溶液中蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、水合作用及其熱動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了總結(jié)并獲得了對(duì)它們的新的認(rèn)識(shí)，提出了

12、紅外和近紅外光譜的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)裝置的新的設(shè)計(jì)。研究結(jié)果不僅對(duì)分子振動(dòng)的理論研究提供了新的思路，而且對(duì)于紅外和近紅外分光法對(duì)蛋白分子的應(yīng)用研究具有一定的參考價(jià)值。論文中所提出的觀點(diǎn)以及創(chuàng)新性歸納如下：①首次將漸進(jìn)因子分析引入到對(duì)蛋白分子的紅外和近紅外光譜解析當(dāng)中，并論證了它是解析動(dòng)力學(xué)過程的有力工具。 ②在利用近紅外分光法研究蛋白分子的水合作用中，論證了加熱導(dǎo)致的蛋白分子水合作用的變化機(jī)理實(shí)質(zhì)上是溶液中自由水和束縛水之間的轉(zhuǎn)化。