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1、近年來(lái),基于元素標(biāo)記策略的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICPMS)定量生物分析已經(jīng)越來(lái)越引起學(xué)術(shù)界關(guān)注。由于生物分子中天然存在的非/類金屬元素(如S,P,Se)和金屬元素(如Fe,Mn,Co,Ni,Zn等)或者存在著元素離子化效率較低,或者有多原子干擾,或者是基于配位作用而導(dǎo)致元素結(jié)合不穩(wěn)定等缺欠,引入外源的金屬元素,特別是鑭系元素及其同位素,來(lái)實(shí)現(xiàn)生物分子的元素標(biāo)記和ICPMS定量分析逐漸成為了主流趨勢(shì),并展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景?;阼|系元
2、素標(biāo)記策略的ICPMS生物分子定量分析方法,具有靈敏度高、線性范圍寬、樣品基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn),特別是同位素稀釋方法的運(yùn)用,使得生物分子絕對(duì)定量結(jié)果更加的準(zhǔn)確和可信。目前而言,基于元素標(biāo)記的生物分子定量分析策略已經(jīng)從傳統(tǒng)的in vitro分析方法學(xué)研究(例如,核酸和模型蛋白質(zhì)標(biāo)記)向?qū)嶋H生物體系中的in vivo生物分子靶向標(biāo)記轉(zhuǎn)變,從而為關(guān)鍵生物學(xué)問(wèn)題的解決提供更多的客觀情報(bào)和研究思路。然而,基于元素標(biāo)記策略的ICPMS生物定量分析的一個(gè)
3、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題就是如何特異性的將金屬元素標(biāo)記到生物分子上去,這種元素標(biāo)記策略必須具有生物特異性好,反應(yīng)動(dòng)力學(xué)迅速,特別是標(biāo)記策略生物兼容性要好,而且具有明確的元素標(biāo)記化學(xué)計(jì)量比等基本條件,這就使得發(fā)展生物分子特異性元素標(biāo)記策略成為了大家越來(lái)越感興趣,同時(shí)也極具挑戰(zhàn)性的研究課題。從分析方法的選擇性和靈敏度兩大核心問(wèn)題出發(fā),我們?cè)诒菊撐闹嗅槍?duì)如何特異性地實(shí)現(xiàn)生物分子元素標(biāo)記并且運(yùn)用到實(shí)際生物體系這一具有挑戰(zhàn)性的科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行了研究。我們以點(diǎn)擊反
4、應(yīng)為橋梁,從基于蛋白酶生物活性和生物代謝的標(biāo)記策略出發(fā),實(shí)現(xiàn)生物分子的特異性/專一性鑭系元素標(biāo)記,解決目標(biāo)生物分子標(biāo)記選擇性和ICPMS檢測(cè)靈敏度的問(wèn)題,并將這種標(biāo)記策略擴(kuò)展到實(shí)際的生物學(xué)體系,探索和嘗試了一些生物學(xué)熱點(diǎn)問(wèn)題的研究。
本研究分為六個(gè)部分:第一章介紹并且梳理近年來(lái)基于元素標(biāo)記策略的生物分子定量分析方法,并且簡(jiǎn)要分析和探討其中存在的問(wèn)題。另外,針對(duì)近年來(lái)在化學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域興起的生物正交反應(yīng)及其在化學(xué)和生物學(xué)研究中
5、的應(yīng)用做了基本的介紹和闡述。第二章以銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)為橋梁,基于酶生物催化活性的元素特異性標(biāo)記策略,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞色素氧化還原酶P4503A4亞型(CYP3A4)的特異性元素銪(Eu)的標(biāo)記,并利用153Eu-形態(tài)非特異性同位素稀釋ICPMS對(duì)其進(jìn)行了絕對(duì)定量分析;與CYP3A4的生物活性關(guān)聯(lián)起來(lái),使得我們不僅可以測(cè)得CYP3A4的絕對(duì)含量,而且能夠從ICPMS測(cè)得的結(jié)果對(duì)其酶催化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。第三章瞄準(zhǔn)活細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶Ome
6、ga1(GSTO1),利用無(wú)銅催化點(diǎn)擊反應(yīng)和酶生物活性的特異性標(biāo)記策略,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)GSTO1的熒光成像和定量分析;利用同位素稀釋ICPMS定量方法研究了抗腫瘤藥物順鉑對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSTO1表達(dá)含量的影響。和熒光成像方法相比,尺寸排阻色譜分離(SEC)與同位素稀釋ICPMS定量方法相結(jié)合能夠克服細(xì)胞內(nèi)游離小分子和多余元素標(biāo)簽的干擾,得到了準(zhǔn)確的GSTO1的定量信息。第四章以細(xì)菌為研究對(duì)象,利用炔基修飾的D-丙氨酸(D-Ala)可以代謝組裝細(xì)
7、菌細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)中,結(jié)合銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)中D-Ala的專一性有機(jī)染料和Eu元素標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)了其成像和定量分析。通過(guò)同位素稀釋的方法得到了細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)中D-Ala的準(zhǔn)確含量,結(jié)合細(xì)菌數(shù)目計(jì)數(shù),我們得到了細(xì)菌表面D-Ala密度這一參數(shù)(dDA),dDA使我們能夠進(jìn)一步考察細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中D-Ala的調(diào)節(jié)功能,也為利用ICPMS進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)分析提供了一條有效途徑。另外,我們著重考察了在抗生素作用下細(xì)菌細(xì)胞壁
8、肽聚糖中D-Ala的含量變化,并對(duì)相應(yīng)的抗生素殺菌機(jī)理和耐藥性機(jī)制做了初步探索和討論,深化了我們對(duì)抗生素以及細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)本身的認(rèn)識(shí),為將來(lái)設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的新抗生素藥物進(jìn)行了理論和技術(shù)儲(chǔ)備。第五章面向細(xì)胞表面的關(guān)鍵糖苷分子-唾液酸糖苷,假以生物特異性代謝機(jī)制并結(jié)合無(wú)銅催化生物正交反應(yīng),實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞表面唾液酸的成像和定量分析。在所建立的軟性多維分析平臺(tái)上可以進(jìn)行熒光分子和元素標(biāo)簽分別標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞表面唾液酸的熒光成像和ICPMS
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