聚乳酸-生物玻璃引導(dǎo)骨再生膜的制備及體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題組選用生物玻璃與聚乳酸，通過熱致相分離法制備成新型的復(fù)合膜，正是利用了二者各自優(yōu)勢(shì)，聚乳酸本身良好機(jī)械性能及物理性能，相容性與可降解性良好，良好的抗拉強(qiáng)度及延展度彌補(bǔ)生物玻璃的缺陷，而且聚乳酸材料表面缺少細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，生物玻璃可作為細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，增強(qiáng)細(xì)胞在其表面上的黏附和增殖，同時(shí)生物玻璃緩沖聚乳酸在降解過程中的酸性產(chǎn)物[13-15]。進(jìn)而通過低溫等離子技術(shù)對(duì)聚乳酸表面進(jìn)行改性，可在不影響聚乳酸自身材料特點(diǎn)的前提下，改善聚復(fù)合膜表

2、面的親水性、黏結(jié)性和生物相容性，使細(xì)胞更易于黏附與材料表面[16-17]。對(duì)其表觀，理化性能和生物相容性進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相同的研究報(bào)道。
　　第一部分低溫氧等離子處理聚乳酸/生物玻璃引導(dǎo)骨再生膜的制備與表征檢測(cè)
　　目的：
　　制備新型的親水性的聚乳酸/生物玻璃引導(dǎo)骨再生膜，并考察復(fù)合膜的表觀形態(tài)、孔隙率，分析其親水和力學(xué)拉伸物理性能。
　　方法：
　　1.按聚乳酸和生物玻璃的質(zhì)量比為9∶1

3、，通過熱致相分離法制備得所需要的聚乳酸-生物玻璃復(fù)合膜，再進(jìn)行低溫氧等離子處理改性，得到表面富含氧極性官能團(tuán)的聚乳酸-生物玻璃引導(dǎo)骨再生膜。
　　2.對(duì)材料整體形態(tài)研究。
　　3.對(duì)復(fù)合膜表面形態(tài)分析，采用JSM-6330F冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡分別對(duì)噴金后PLLA/BG復(fù)合膜進(jìn)行表面形貌分析。并采用Photoshop軟件。用其測(cè)量膜結(jié)構(gòu)纖維的直徑和孔隙大小。
　　4.對(duì)復(fù)合膜孔隙率的測(cè)定，利用液體（無(wú)水乙醇）置換法測(cè)得。

4、比重瓶中裝滿乙醇后的質(zhì)量為W1(g)，把質(zhì)量為Ws(g)的樣品浸入裝乙醇的比重瓶中脫氣。使乙醇充盈于多孔膜材料的孔中。復(fù)添加滿乙醇，此時(shí)裝有樣品和乙醇的比重瓶質(zhì)量為W2(g)。取出充滿乙醇的樣品后，剩余的乙醇與比重瓶質(zhì)量為W3(g)[18]。
　　復(fù)合膜的孔隙率計(jì)算公式如下:
　　P代表材料的孔隙率(％);V0代表材料在自然狀態(tài)下的體積，或稱表觀體積(cm3);V代表材料的絕對(duì)密實(shí)體積(cm3)P=V0-V/V0×100％=

5、W2-W3--Ws/W1-W3×100％
　　5.對(duì)復(fù)合膜的水接觸角度測(cè)試，采用OCA15表面接觸角分析儀測(cè)定樣本的表面接觸角，在每個(gè)標(biāo)本的3個(gè)不同位置滴雙蒸水10μL，讀取接觸角并取平均值。
　　結(jié)果：
　　1.從復(fù)合膜整體表面上觀察，膜呈白色或淡黃，不平整。本研究制備的膜材料直徑大小約為1.5 cm，高度約為2mm，其具有壓縮性。
　　2.本實(shí)驗(yàn)制備的純PLLA膜為納米級(jí)纖維多孔連通結(jié)構(gòu)，孔隙直徑大小約為1～

6、4μm，聚乳酸纖維直徑約為160～320nm，當(dāng)PLLA與BG的質(zhì)量比為9∶1時(shí)，BG顆粒能夠較好地吸附在PLLA基質(zhì)中，整體分散結(jié)合在納米級(jí)纖維支架內(nèi)，可觀察到BG/PLLA膜的纖維直徑及孔隙與PLLA膜相比未見明顯變化，不影響材料的結(jié)構(gòu)及連通性。
　　3.純聚乳酸膜材料的孔隙率高達(dá)93.926％，加入BG的PLLA/BG復(fù)合膜無(wú)論是否經(jīng)過氧等離子處理的兩組膜孔隙率相對(duì)降低，分為93.048±0.121％和93.046±0.14

7、5％，基本不會(huì)影響膜材料的整體結(jié)構(gòu)。3組屏障膜材料均具有較高的孔隙率。
　　4.表面接觸角分析儀示PLLA膜的水接觸角度為118.85°±5.88°，未經(jīng)處理的PLLA/BG復(fù)合膜的水接觸角度為99.42°±5.86°，經(jīng)過氧等離子處理后的PLLA/BG復(fù)合膜的水接觸角度為81.32±5.77°，其差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明經(jīng)過氧離子處理后的PLLA/BG膜其親水性能明顯得到改善。
　　5.力學(xué)拉伸測(cè)試示PLLA膜的拉伸強(qiáng)度

8、可達(dá)34.6±1.5MPa，未經(jīng)處理的PLLA/BG復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度達(dá)27.1±1.4 MPa，經(jīng)過氧等離子處理后的PLLA/BG復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度達(dá)20.8±2.1 MPa，在復(fù)合膜中加入生物玻璃可能影響聚乳酸的規(guī)整性，阻礙結(jié)晶，降低結(jié)晶度，導(dǎo)致強(qiáng)度下降，經(jīng)氧等離子處理材料的拉伸強(qiáng)度仍可保持20 MPa以上，可能由于氧離子處理過程中造成材料表面刻蝕，導(dǎo)致拉伸強(qiáng)度下降，較PLLA或未處理PLLA/BG材料均有明顯下降。
　　結(jié)論：<

9、br>　　本研究所制備的PLLA/BG引導(dǎo)骨再生膜具有納米纖維狀三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，生物玻璃散在分布在支架內(nèi)部。具有良好的孔隙率，具有親水性，在力學(xué)拉伸試驗(yàn)中表現(xiàn)出一定抗拉伸性能的特點(diǎn)，證明膜構(gòu)成穩(wěn)定。
　　第二部分低溫氧等離子處理聚乳酸/生物玻璃引導(dǎo)骨再生膜的細(xì)胞生物相容性研究
　　目的：
　　檢測(cè)氧等子處理聚乳酸/生物玻璃引導(dǎo)骨再生膜的生物相容性及是否具備促成骨性能
　　方法：
　　1.檢測(cè)復(fù)合膜上MG63細(xì)

10、胞細(xì)胞黏附率，接種100μL密度為1×106的細(xì)胞懸浮液于24孔板內(nèi)已預(yù)濕的三組膜（PLLA膜、PLLA/BG膜、經(jīng)氧等離子處理PLLA/BG膜）。接種后1h、3h、6h分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞黏附率，每組每次取出3孔，吸出培養(yǎng)基，計(jì)算培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)目(A1)，取出材料后，對(duì)該孔貼孔壁細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)為(A2)。（其中A0為接種細(xì)胞數(shù)）
　　按以下公式:細(xì)胞黏附率(Adhesion rate)=[(A0-A1-A2)/A0]×

11、100％
　　2.Hoechst染色檢測(cè)復(fù)合膜上MG63細(xì)胞黏附能力，將接種100μL密度為5×105的MG63細(xì)胞懸液于24孔板內(nèi)已預(yù)濕的三組膜（PLLA膜、PLLA/BG膜、經(jīng)氧等離子處理PLLA/BG膜）。分別培養(yǎng)1h，3h，6h后取出，PBS漂洗，加入4％多聚甲醛固定10mim，反復(fù)PBS漂洗，滴加10μg/ml的Hoechst液體300μL，于室溫孵育30min，PBS沖洗，濾紙吸去表面殘留PBS液體，立即入熒光顯微鏡下

12、觀察。
　　3.檢測(cè)復(fù)合膜上MG63細(xì)胞增殖率，接種100μL密度為5×105細(xì)胞懸浮液，于24孔板內(nèi)已預(yù)濕的三組膜（PLLA膜、PLLA/BG膜、經(jīng)氧等離子處理PLLA/BG膜），分別于1d、3d、5d，取出材料，漂洗，移入新24孔板，加入新鮮培養(yǎng)基300 ul后避光加入MTS60μL，置入37℃恒溫箱孵育3h后，每孔取2次，每次取100μL加入96孔板，置于酶標(biāo)儀內(nèi)于波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)量各孔吸光度值（OD值）。
　　

13、4.SEM電鏡掃面觀察復(fù)合膜上MG63細(xì)胞形態(tài)及鈣化結(jié)節(jié)，將預(yù)濕氧等離子處理PLLA/BG復(fù)合膜置于24孔板內(nèi)，接種100μL密度為1×104的MG63細(xì)胞懸液。分別培養(yǎng)3d、7d后棄培養(yǎng)基，用2.5％戊二醇4℃固定過夜;梯度乙醇溶液逐級(jí)脫水;噴金;掃描電子顯微鏡下觀察在樣本表面的黏附、增殖及鈣化結(jié)節(jié)形成狀態(tài)。
　　5.接種100μL密度為5×105的MG63細(xì)胞懸液于24孔板內(nèi)已預(yù)濕的三組膜(PLLA膜、PLLA/BG膜、經(jīng)氧等

14、離子處理PLLA/BG膜)，置于孵育箱中培養(yǎng)3d、7d、14d，用PBS蕩洗3次，每孔加入200μL1％TritonⅩ-100，靜置于4℃冰箱裂解10～15h，每孔取30μL加入96孔板中，按照堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒操作說明依次加入各試劑后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光值（OD值）[19]。
　　結(jié)果:
　　1.隨細(xì)胞接種時(shí)間的延長(zhǎng)，3組膜的細(xì)胞粘附率均有增高，其中PLLA與未處理PLLA/BG兩

15、組膜在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)其細(xì)胞粘附率差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，經(jīng)氧等離子處理的復(fù)合膜粘附率高于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.由Hoechst染色染色結(jié)果示MG-63細(xì)胞在三組膜上的黏附增殖情況存在明顯差異，由于PLLA表面的疏水性，導(dǎo)致1h和3h時(shí)僅有極少量的細(xì)胞黏附在PLLA膜或PLLA/BG膜表面，經(jīng)過氧等離子處理PLLA/BG膜在早期明顯促進(jìn)細(xì)胞黏附，在三組材料的第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1h)鏡下可見細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核染藍(lán)色

16、熒光，細(xì)胞散在分布，3h時(shí)熒光量增加，而6h時(shí)MG63細(xì)胞在各組膜的黏附率均增高，經(jīng)氧等離子處理的復(fù)合膜上熒光量顯著增加。
　　3.隨細(xì)胞接種時(shí)間的延長(zhǎng)，3組膜的細(xì)胞增殖率均有提高，其中經(jīng)過氧等離子處理PLLA/BG膜細(xì)胞增殖率在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于PLLA膜或未處理PLLA/BG膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，未處理PLLA/BG膜與PLLA膜細(xì)胞增殖率差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.掃描電鏡下可見在氧等離子處理PLLA

17、/BG復(fù)合膜上培養(yǎng)3d后，MG63細(xì)胞呈梭形、多邊形，黏附于膜表面，絲狀偽足開始向各方向伸展，與復(fù)合膜相互緊密交聯(lián)，可見細(xì)胞胞漿豐富。經(jīng)7d培養(yǎng)后，細(xì)胞總體數(shù)量明顯增多，并生發(fā)生遷移匯合，呈片狀生長(zhǎng)趨勢(shì)，覆蓋疊層，見細(xì)胞鈣化基質(zhì)數(shù)量逐漸增多沉淀。細(xì)胞覆蓋匯合呈片狀或鱗狀后，整體增殖減緩，開始分泌細(xì)胞鈣化基質(zhì)。由于細(xì)胞覆層疊蓋，導(dǎo)致細(xì)胞間分界在電鏡下觀察模糊，因此在低倍數(shù)電鏡下觀察可見數(shù)個(gè)呈片狀或鱗狀細(xì)胞團(tuán)塊與膜三維網(wǎng)狀支架交聯(lián)，散在獨(dú)立

18、分布，細(xì)胞團(tuán)塊外周可見細(xì)胞突起相互纏繞，并可見細(xì)胞分泌球形狀的鈣化基質(zhì)，這些分泌的細(xì)胞鈣化基質(zhì)發(fā)生礦化后，形成鈣化結(jié)節(jié)。
　　5.MG63細(xì)胞在三組膜上的ALP活性總體趨勢(shì)呈隨時(shí)間推移先增高后降低，在第7天達(dá)峰值。在第三天檢測(cè)結(jié)果示:加入BG的兩組復(fù)合膜的OD值均高于PLLA膜組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在另外兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，三組膜的OD值之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本研究所制備的