大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的酶活性抑制效應(yīng)及構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、我國(guó)現(xiàn)已成為抗生素生產(chǎn)與消費(fèi)的第一大國(guó)，也是濫用抗生素最嚴(yán)重國(guó)家之一，大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收，有高達(dá)85％以上抗生素以原形或代謝物形式由病人和畜禽排泄物排入環(huán)境，由此帶來(lái)的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題逐漸引起關(guān)注。
　　為了對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的環(huán)境行為進(jìn)行系統(tǒng)分析，本文實(shí)地調(diào)查了畜禽養(yǎng)殖中抗生素使用情況，在此基礎(chǔ)上選取了11種典型大環(huán)內(nèi)酯抗生素，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的測(cè)試工作，實(shí)施了大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)酶的活性抑制實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用專(zhuān)業(yè)化學(xué)辦公軟件構(gòu)

2、建了大環(huán)內(nèi)酯抗生素的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖并對(duì)其結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行了計(jì)算，借助統(tǒng)計(jì)分析手段，探究大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)之間的定量關(guān)系。為進(jìn)一步研究大環(huán)內(nèi)酯抗生素在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，本文最后建立了高效液相色譜法檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的方法體系。主要研究結(jié)果簡(jiǎn)述如下:
　　1.通過(guò)對(duì)安徽省宣城市某鄉(xiāng)鎮(zhèn)大型養(yǎng)殖公司及多家私人養(yǎng)殖戶(hù)進(jìn)行走訪調(diào)查，發(fā)現(xiàn)畜禽養(yǎng)殖中抗生素的使用上存在不少問(wèn)題，主要有以下六個(gè)方面:(1)盲目、隨意用藥問(wèn)題突出;(2)過(guò)量、長(zhǎng)

3、期使用抗生素情況普遍;(3)禁用抗生素的使用時(shí)有發(fā)生;(4)人藥獸用現(xiàn)象依然存在;(5)藥物配伍不當(dāng)現(xiàn)象明顯;(6)不按規(guī)定休藥期用藥。
　　2.根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素抑菌作用機(jī)制，通過(guò)分析大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)酶活性抑制作用研究現(xiàn)狀，以大環(huán)內(nèi)酯抗生素對(duì)酶活性的抑制效應(yīng)為突破口，選取乙酰膽堿酯酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作為靶標(biāo)酶，通過(guò)測(cè)試大環(huán)內(nèi)酯脅迫下乙酰膽堿酯酶（促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)）和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（促進(jìn)轉(zhuǎn)肽作用）的抑制效應(yīng)，結(jié)合大環(huán)內(nèi)酯分子結(jié)構(gòu)特征，

4、揭示大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)酶抑制機(jī)理。
　　(1)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用的有機(jī)溶劑會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生一定的影響，為選取適宜的有機(jī)溶劑，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，根據(jù)文獻(xiàn)分析，在酶活性抑制前期實(shí)驗(yàn)中，選取了甲醇、乙醇、異丙醇、冰醋酸、丙酮、乙腈、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯和氯仿10種有機(jī)溶劑，測(cè)定了其對(duì)酶活性的影響。10種有機(jī)溶劑對(duì)兩種酶的抑制能力順序基本一致，但又存在差別，本文分別選取乙醇和乙腈作為對(duì)乙酰膽堿酯酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶抑制作用實(shí)驗(yàn)

5、用有機(jī)溶劑。
　　(2)本文測(cè)試了11種典型大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)乙酰膽堿酯酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的系列抑制程度，并用直線內(nèi)插法計(jì)算了相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度IC50(50％ InhibitoryConcentration)，結(jié)果表明在較低濃度下，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)兩種酶的抑制作用較弱，其中對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制能力排序?yàn)?制霉素＜羅紅霉素＜麥迪霉素＜吉他霉素＜乙酰螺旋霉素＜阿奇霉素＜紅霉素＜泰樂(lè)菌素＜阿維菌素＜克拉霉素＜兩性霉素B，其中兩性霉素B的

6、抑制強(qiáng)度是制霉素的455倍;對(duì)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶抑制能力排序?yàn)?乙酰螺旋霉素＜麥迪霉素＜吉他霉素＜制霉素＜紅霉素＜克拉霉素＜羅紅霉素＜泰樂(lè)菌素＜阿奇霉素＜阿維菌素＜兩性霉素B，其中兩性霉素B的抑酶強(qiáng)度是乙酰螺旋霉素的950倍，接近3個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)兩種酶抑制作用最強(qiáng)的均為兩性霉素B，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖可以看出兩性霉素B分子中含羥基數(shù)量最多，易通過(guò)氫鍵與酶結(jié)合，從而影響并改變酶分子構(gòu)象，減少酶分子與底物結(jié)合或者降低其結(jié)合穩(wěn)定性，致使酶催化活性減弱。

7、
　　3.為進(jìn)一步揭示有機(jī)溶劑與大環(huán)內(nèi)酯抗生素對(duì)酶活性抑制的機(jī)理，建立了有機(jī)溶劑和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)兩種酶活性抑制的QSAR（QuantitiativeStructure-Property/Activity Relationships）模型。以有機(jī)溶劑和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)酶的抑制率為因變量，以分子結(jié)構(gòu)參數(shù)為自變量，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS，通過(guò)多元線性逐步回歸方法建立QSAR模型，根據(jù)模型穩(wěn)健性檢驗(yàn)并結(jié)合引入?yún)?shù)分析解釋有機(jī)溶劑和大環(huán)

8、內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)酶抑制作用機(jī)理。
　　(1)有機(jī)溶劑對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用QSAR模型:有機(jī)溶劑對(duì)酶的抑制率IR（Inhibition Ratio）=-193.939+147.660*(AAC)+112.824*(SEige), n=10, R=0.960, R2=0.921, F=41.055,Sig=0.000, P=0.4。
　　方程中參數(shù)AAC和SEige均為二維拓?fù)渲笖?shù)描述符，AAC表征原子組成平均信息指數(shù)，SEi

9、ge表征電負(fù)性特征值總數(shù)，兩種描述符的引入說(shuō)明有機(jī)溶劑原子間的組合方式?jīng)Q定整個(gè)有機(jī)溶劑分子的電負(fù)性，并且隨著兩種描述符數(shù)值的增加，有機(jī)溶劑對(duì)酶的抑制率增強(qiáng)，因此有機(jī)溶劑對(duì)乙酰膽堿酯酶活性抑制作用取決于有機(jī)溶劑的原子組成和分子電負(fù)性。
　　(2)大環(huán)內(nèi)酯對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用QSAR模型:IC50=9354.291-1216.501*(GGI3)-93.782*(RDF105e), n=11, R=0.934, R2=0.872,

10、F=31.054, Sig=0.000, P=0.2。
　　GGI3表征拓?fù)潆姾芍笖?shù)，為二維空間結(jié)構(gòu)Galvez拓?fù)渲笖?shù)描述符。RDF105e表征原子電負(fù)性加權(quán)的徑向分布函數(shù)，為三維空間結(jié)構(gòu)的RDF描述符，兩種描述符的引用說(shuō)明大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用主要取決于其分子結(jié)構(gòu)特定方向上的電負(fù)性，并隨電負(fù)性的提高，抑制率增強(qiáng)。
　　(3)有機(jī)溶劑對(duì)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的抑制作用QSAR模型:IR=68.985-176.102

11、*(E3u), n=10, R=0.920, R2=0.846, F=29.058, Sig=0.000149。
　　E3u參數(shù)為WHIM指數(shù)，表征未加權(quán)第三主軸Z軸方向上的指向性指數(shù)，說(shuō)明有機(jī)溶劑對(duì)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶抑制效應(yīng)主要受其特定方向上的原子連接性影響。
　　(4)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶抑制作用QSAR模型:IC50=41337.302-8477.261*(GGI3)+415.436(RDF060p), n=11,

12、 R=0.897, R2=0.805,F=16.531, Sig=0.00, P=0.000。
　　模型中GGI3為拓?fù)潆姾芍笖?shù)，表征二維空間結(jié)構(gòu)Galvez拓?fù)渲笖?shù)描述符。RDF060p表征原子極化率加權(quán)的徑向分布函數(shù)，為三維空間結(jié)構(gòu)的RDF描述符，兩種描述符的引用說(shuō)明大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的抑制作用主要取決于其分子結(jié)構(gòu)特定方向上的極化率。
　　有機(jī)溶劑與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)兩種酶的抑制作用基本是一致的，主要取決于特

13、定方向上的電負(fù)性與極化率，但由于兩種酶的分子空間排列不同，導(dǎo)致有機(jī)溶劑對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制程度相比谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶增加;大環(huán)內(nèi)酯分子進(jìn)攻酶分子的點(diǎn)位不同，進(jìn)攻乙酰膽堿酯酶點(diǎn)位編號(hào)105，進(jìn)攻谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶點(diǎn)位編號(hào)060。
　　4.為幫助課題組進(jìn)一步系統(tǒng)分析大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件建立了大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法。本研究中阿奇霉素的色譜保留時(shí)間為2.067min，紅霉素為2.305min，克拉霉素2.158min