響應(yīng)氨基葡萄糖的glmS核酶生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、氨基葡萄糖（GlcN）是人體關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中合成蛋白聚糖所必需的重要成分。它對于人體及動物體的關(guān)節(jié)健康和身體的免疫調(diào)節(jié)具有重要的作用。目前商品化的GlcN全部是來自蝦、蟹等甲殼原料的高溫水解,生產(chǎn)過程能耗大，污染嚴(yán)重，因此，有必要從根本上改變GlcN的生產(chǎn)方法。利用微生物發(fā)酵法直接合成GlcN是理想的策略，在此前報道中已有利用微生物發(fā)酵直接合成 GlcN的先例，但其無法解決在發(fā)酵過程種實(shí)時檢測GlcN變化的問題。glmS核糖開關(guān)是至今發(fā)現(xiàn)

2、的唯一能夠調(diào)控糖代謝的核糖開關(guān)，只存在于革蘭氏陽性菌中，位于編碼氨基葡萄糖合酶的mRNA的5'UTR內(nèi)，它需要小分子物質(zhì)GlcN-6P才能激活，這在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的核酶中是非常少見的，目前對glmS核糖開關(guān)的相關(guān)研究較少。
　　本文的主要內(nèi)容為：利用 glmS核糖開關(guān)與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白構(gòu)建生物傳感器，并在枯草芽孢桿菌中驗(yàn)證其功能。本文首次將釀酒酵母的氨基葡萄糖合酶基因（gfa1）和枯草芽孢桿菌的氨基葡萄糖合酶基因（glms）分別與氨基

3、葡萄糖乙酰化酶基因（gna1）連接，再與glms生物傳感器相連接，（1）gfa1-gna1-生物傳感器利用枯草芽孢桿菌表達(dá)載體 PHT01質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到安全菌株枯草芽孢桿菌WB800N中；(2) glms-gna1-生物傳感器分別通過表達(dá)載體PHT01質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到安全菌株枯草芽孢桿菌WB800N中；(3) glms-gna1-生物傳感器直接整合到枯草芽孢桿菌WB800N中。通過比對熒光強(qiáng)度和GlcN含量，確定熒光強(qiáng)度和GlcN含量的關(guān)系。

4、并通過熒光強(qiáng)度和GlcN的對比，篩選出高產(chǎn)GlcN的菌株。
　　研究結(jié)果表明，實(shí)現(xiàn)gfa1與gna1組合和glms與gna1組合兩種組合通過穿梭質(zhì)粒和整合基因組兩種不同方式在枯草芽孢桿菌表達(dá)體系里的表達(dá)，以上基因的表達(dá)，成功提高胞內(nèi)GlcN及GlcNAc的含量。并通過分析GlcN含量與熒光表達(dá)的關(guān)系，最終得出整合型工程菌WB800N-glms-gna1-Ribo-egfp最終發(fā)酵結(jié)果最好，最終產(chǎn)量達(dá)到20.4g/L，是原始菌Glc