疏水電荷誘導(dǎo)介質(zhì)的制備及在抗體分離的應(yīng)用.pdf

1、抗體類藥物是目前生物技術(shù)類藥物中最重要的一類，因其專一性強(qiáng)、親和力高，在醫(yī)藥和研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。這類藥物在生物醫(yī)藥市場(chǎng)的規(guī)模已經(jīng)超過(guò)20%，且呈逐年增加的趨勢(shì)。隨著市場(chǎng)需求和生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，如何從復(fù)雜的料液中快速、高效的分離純化抗體，以提高抗體類產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性是目前生物工程領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。本論文針對(duì)抗體的色譜分離過(guò)程，提出了一種基于三唑基團(tuán)的新型疏水電荷誘導(dǎo)吸附劑的制備方法。該方法利用三唑及衍生物對(duì)抗體分子的

2、選擇性吸附作用，實(shí)現(xiàn)抗體在生理?xiàng)l件下與配基結(jié)合；并在弱酸條件下利用靜電排斥作用實(shí)現(xiàn)抗體的洗脫，從而克服了上樣條件復(fù)雜，洗脫條件苛刻等問(wèn)題。本論文的研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面：
　?。?）研究了以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，利用點(diǎn)擊化學(xué)固載三唑衍生物基團(tuán)，考查其對(duì)三種模式蛋白的吸附行為。研究發(fā)現(xiàn)三唑衍生物在蛋白吸附過(guò)程中具有pH依賴性，且吸附容量受鹽濃度的影響較小，這些特征符合疏水電荷誘導(dǎo)層析的典型特征。人抗體IgG在中性pH條件下吸附容量最高

3、，達(dá)到15 mg/mL gel，此條件下對(duì)其他蛋白的吸附量較低。上述結(jié)果表明，三唑及其衍生物有作為疏水電荷誘導(dǎo)層析吸附劑的潛力，需進(jìn)一步的考查高配基密度下的抗體載量及選擇性。
　?。?）為提高抗體載量，以親水性聚苯乙烯微球?yàn)檩d體，結(jié)合原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（Atom transfer radical polymerization, ATRP）技術(shù)和銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)(Cu-catalyzed click reaction)，成功地制備了

4、高密度三唑基疏水電荷誘導(dǎo)層析吸附劑?？疾榱巳芤簵l件和材料性質(zhì)對(duì)抗體吸附的影響，靜態(tài)飽和吸附容量（Qm）達(dá)到240 mg/g，動(dòng)態(tài)吸附容量高達(dá)88 mg/g；以檸檬酸緩沖液（0.01 mol/L, pH3.0）為洗脫劑，洗脫效率超過(guò)80%，重復(fù)使用后吸附容量未發(fā)生明顯下降。通過(guò)SDS-PAGE分析，三唑基疏水電荷誘導(dǎo)層析吸附劑在分離復(fù)雜溶液中的抗體時(shí)具有較高的選擇性，pH4.0的檸檬酸洗脫液液洗脫，IgG的純度達(dá)到95%以上。
　　

5、（3）針對(duì)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜，銅離子較難去除等實(shí)際問(wèn)題，本文又篩選了新的三唑衍生物：5-羧基苯并三唑，實(shí)現(xiàn)了疏水電荷誘導(dǎo)層析凝膠介質(zhì)的簡(jiǎn)易制備。在生理?xiàng)l件下，苯并三唑吸附劑對(duì)IgG的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量高達(dá)57.7 mg/mL gel，較傳統(tǒng)的疏水作用色譜提高60%以上；以人血漿中抗體為分離目標(biāo)，利用pH4.0的檸檬酸緩沖液一步洗脫，純度超過(guò)95%，收率超過(guò)70%，且降低洗脫緩沖液pH，有利于提高抗體回收率。此外，苯并三唑吸附劑對(duì)牛