黑曲霉糖化酶淀粉結(jié)合區(qū)環(huán)化重排及其對(duì)糖化酶生淀粉降解性能的影響.pdf

1、淀粉酶可以水解普通淀粉，但只有百分之十的淀粉酶可以結(jié)合并分解生淀粉。糖化酶(Glucoamylase，GA)是一類具有特殊生淀粉結(jié)合能力的淀粉水解酶，該類淀粉酶具有一類重要的結(jié)構(gòu)域，淀粉結(jié)合區(qū)(Starch-binding Domain，SBD)。SBD具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值:在糧食加工和淀粉液化過程中，選擇性地去除織物中的淀粉，重組蛋白質(zhì)的親和純化和提高非淀粉分解酶的效率。但是在工業(yè)應(yīng)用中因?yàn)榘l(fā)酵過程中糖化酶(GA)的表達(dá)量偏低以及雜

2、蛋白的存在，其分離純化較困難。此外現(xiàn)有的生淀粉降解酶活性不足，需要通過高溫蒸煮，經(jīng)過糊化、糖化過程才能利用生淀粉，造成能量消耗偏大、成本過高。這使得我們迫切需要構(gòu)建表達(dá)量高，分離純化簡(jiǎn)單，能耗小且生淀粉降解酶活性較高的重組菌株。
　　蛋白質(zhì)環(huán)化重排是通過共價(jià)連接氨基端和羧基端，裂解某個(gè)鈦鍵重新獲得新的N-末端和C-末端的過程。通過環(huán)化重排處理之后能夠提高蛋白質(zhì)催化能力和配體親和性[86,87]，改變底物選擇性[88,89]，改變低

3、聚反應(yīng)狀態(tài)[90]和在蛋白水解消化過程中提高穩(wěn)定性[91]。
　　本研究旨在通過研究黑曲霉糖化酶的SBD結(jié)構(gòu)域環(huán)化重排獲得不同N-末端后，插入環(huán)化重排SBD片段的重組菌株所表達(dá)的蛋白質(zhì)與生淀粉結(jié)合性能的變化。另外研究在環(huán)化重排SBD片段的影響下，具有不同SBD結(jié)構(gòu)域的黑曲霉糖化酶與生淀粉和普通淀粉親和性的變化及其酶活性的研究。
　　我們以黑曲霉基因組為模板，擴(kuò)增得到黑曲霉GA的SBD結(jié)構(gòu)域序列ANG-SBD和糖化酶全長(zhǎng)序列A

4、NG。通過隨機(jī)環(huán)化重排獲得六種環(huán)化突變基因:ANGCP527、ANGCP546、ANGCP559、ANGCP585、ANGCP593和ANGCP605。六種環(huán)化突變基因和原始ANG-SBD基因插入質(zhì)粒pet28a重組獲得原核表達(dá)體系，經(jīng)表達(dá)純化后比較不同環(huán)化變換突變后的SBD的生淀粉結(jié)合性能的差異。同時(shí)為比較不同SBD突變對(duì)糖化酶生淀粉降解性能的影響，將全長(zhǎng)序列ANG插入質(zhì)粒pPIC9K重組獲得畢赤酵母真核表達(dá)體系，并用六個(gè)環(huán)化重排基因

5、替換ANG-SBD-pPIC9K重組質(zhì)粒的原始SBD結(jié)構(gòu)域序列，構(gòu)建獲得六種整合型分泌表達(dá)淀粉酶的重組菌株:CP527，CP546，CP559，CP585，CP593和CP605。
　　結(jié)果表明:環(huán)化重排菌株CP546、CP559和CP593的生淀粉結(jié)合能力和水解比活相對(duì)于原始菌株都有較大程度的提高，其中CP546的生淀粉結(jié)合能力最強(qiáng)，其生淀粉結(jié)合能力是對(duì)照組的1.5倍，相對(duì)應(yīng)的CP546純化后的純糖化酶液對(duì)生淀粉水解性能也最高為

6、5.59IU/mg，對(duì)照組是4.51IU/mg，水解比活大概提高20％。CP559和CP593對(duì)生淀粉結(jié)合能力分別提高27％和33％。而另外兩株環(huán)化重排菌株CP527，CP585的生淀粉結(jié)合能力和水解比活有較大程度的降低，CP605的生淀粉結(jié)合能力和生淀粉降解能力變化不大。而環(huán)化重排菌株的糖化酶可溶性淀粉水解比活相對(duì)于對(duì)照組變化不大，保持原來(lái)水平基本不變。
　　本課題研究結(jié)果表明，SBD結(jié)構(gòu)域環(huán)化重排后，其生淀粉結(jié)合能力越高相對(duì)應(yīng)